数字PCR方法准确测量质粒DNA拷贝浓度

董莲华;隋志伟;王晶;傅博强

【摘 要】中国计量科学研究院(NIM)利用数字PCR技术针对国际比对样品质粒DNA,通过设计2对特异性的引物和探针、优化PCR扩增体系、排除PCR mastermix中的DNA污染,成功建立了定量该质粒DNA的数字PCR方法.比较了采用单重PCR和双重PCR方法定量结果之间的差异,最终实现了对比对样品的定量和不确定度评定.对线性质粒样品的测量结果及其扩展不确定度(k=2)为(8.06±0.55)×103 copies/mg,该结果在比对参考值不确定度范围内,且与参考值非常接近.%NIM established two digital polymerase chain reaction (dPCR) assays for quantifying the plasmid DNA sample, including designing two pairs of specific primer and probe, optimizing PCR amplifying conditions and excluding the DNA contamination in the PCR mastermix.The measurement results by simplex and duplex dPCR are compared.The DNA sample is successfully quantified by the established dPCR method and the measurement uncertainty is eventually evaluated.The measurement result with its expanded uncertainty (k=2) is (8.06±0.55)×103copies/mg, it agree well with the reference value within the standard uncertainty and very close to the reference value.

【期刊名称】《计量学报》

【年(卷),期】2017(038)002

【总页数】5页(P247-251)

【关键词】计量学;质粒DNA;数字PCR;拷贝浓度;国际比对;可比性

【作 者】董莲华;隋志伟;王晶;傅博强

【作者单位】中国计量科学研究院, 北京 100029;中国计量科学研究院, 北京 100029;中国计量科学研究院, 北京 100029;中国计量科学研究院, 北京 100029

【正文语种】中 文

【中图分类】TB99

核酸含量测量具有广泛的应用，如转基因检测、食品中微生物污染以及临床中传染病诊断等方面均涉及到核酸含量的测量。数字PCR (dPCR)方法是一种可以实现对核酸绝对定量的测量方法，与实时荧光定量PCR方法相比，因其不依赖于核酸外标[1,2]、对PCR抑制剂不敏感[3]、测量结果更准确[4]且可直接溯源至SI单位，而逐渐被用于核酸标准物质的定值研究中[5～7]，通过dPCR方法定值的核酸标准物质可以用来校准其它的分子方法。

尽管如此，数字PCR方法要成为核酸定量的参考方法，还有待于对其进行更深入研究，包括方法的系统误差和随机误差，实验室间可比性，以及与其它方法之间的可比性等因素。为此，国际计量局(BIPM)下设的物质量咨询委员会(CCQM)生物分析工作组(BAWG)组织了针对核酸绝对定量方法研究的国际计量比对(CCQM.P154)，本研究就是中

国计量科学研究院代表国家参加此次国际计量比对的任务下进行的。针对主导实验室发出的盲样——2种不同构象的质粒DNA，建立和优化数字PCR定量方法，实现了对国际比对样品的准确测量。

2.1 DNA样品

DNA样品是由主导实验室韩国国家计量院(KRISS)提供的线性化和超螺旋的pBR322质粒DNA盲样，各5瓶，分别标记为E37、E58、E64、E68、E89和O46、O66、O78、O79、O99。2.2 仪器与试剂

Roche Light Cycle 480实时荧光定量PCR仪(瑞士罗氏诊断公司)；BioMark数字PCR仪(美国Fluidigum公司)。

Gene Expression Mastermix(GE)、Environmental Mastermix(EN)和16S DNA free Mastermix(DF)3种实时荧光定量PCR试剂盒，前2种购自美国Life Technologies公司，后1种购自美国Molzym公司。

2.3 实验方法

2.3.1 引物探针设计

根据pBR322质粒DNA的全序列，使用Primer Express 2(Applied Biosystem)软件进行引物和探针的设计，共设计了2对引物/探针对进行PCR方法的优化和建立，见表1。

2.3.2 探针浓度优化

PCR体系中上下游引物浓度分别为400 nmol/L，设置探针浓度分别为100，200，300，400 nmol/L，然后加入12.5 μL PCR mastermix，DNA模板5 μL，用1×TE0.1补足25 μL。然后进行qPCR扩增。扩增条件确定为：95 ℃，4 min，40个循环；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min。

2.3.3 PCR mastermix选择

由于该质粒DNA为生产PCR扩增用的酶制剂的工程菌中常用的载体，在进行PCR扩增时使用的酶制剂通常会存在与目标DNA同源性高的非目标DNA的污染，因此，在选择PCR扩增的mastermix时需要避免污染，本研究中,共比较了3种PCR mastermix，分别为Gene Expression Mastermix(GE)、Environmental Mastermix(EN)和16S DNA free Mastermix(DF)。

2.3.4 酶切超螺旋质粒样品

采用EcoR1限制性内切酶对超螺旋的质粒样品进行线性化，酶切体系为50 μL，包括5 μL的10×buffer、2.5 μL的EcoR1、17.5 μL的ddH2O和25 μL质粒DNA。同时做无内切酶的对照，酶切和无内切酶对照分别标记为O66-E和O66-CK。

2.3.5 数字PCR定量

利用优化好的qPCR条件，对未知浓度的质粒DNA样品进行数字PCR定量分析。

首先各取1瓶线性化和超螺旋的DNA样品，采用48×770 Digital array的数字PCR芯片对上样的浓度进行优化，同时分析超螺旋样品酶切与非酶切的差异。按照仪器操作说明，根据泊松分布和数字PCR芯片每个panel的反应小室个数(770)，每个panel中阳性反应室数目控制在200～700之间，得到的测量结果准确度高，因此根据qPCR测定结果对未知样品浓度进行了估算，并对2倍的稀释进行测定。数字PCR扩增体系5 μL，包括2 μL的DNA Free mastermix、0.16 μL的Taq聚合酶、上下游引物各0.2 μL、0.15 μL的3P探针(Assay3)或0.1 μL的4P探针(Assay4)，0.1 μL的ROX染料、0.25 μL的GE loading、1 μL的DNA样品，最后用TE0.1补足5 μL。在确定好上样的浓度后，采用48×770数字PCR芯片分析其余4瓶样品。

每个panel的DNA拷贝数为

样品浓度为

式中：P为阳性反应室个数；N为总反应室个数；D为稀释因子；VP为单反应室体积；ρ为反应液的密度。

2.4 不确定度分析

根据测量结果的计算式，不确定度来源包括测量重复性M，稀释因子D、单反应室体积VP和密度ρ。不确定度计算为

3.1 qPCR扩增探针浓度的确定

Assay3的探针浓度在0.1、0.2、0.3、0.4 μmol/L时，对应的平均拷贝数Cq值分别为22.36、22.39、22.01、19.42，因此，由Cq值可以确定探针(3P)的浓度为0.4 μmol/L时，PCR扩增效率最高，由扩增曲线看探针浓度为0.4 μmol/L时，荧光强度最强。Assay4的探针浓度在0.1、0.2、0.3、0.4 μmol/L时，对应的Cq值分别为27.61、27.36、27.58、27.95，由Cq值看，探针4P的浓度为0.2 μmol/L时，PCR扩增效率最高。

3.2 PCR mastermix选择

图1为对Assay3和Assay4分别使用DNA Free(DF)型和Environmental(EN)型的mastermix，对线性(E37)和超螺旋(O66)质粒定量扩增结果。由图可知，Assay3和Assay4 中使用EN型的mastermix扩增结果中，NTC(No template control，没有DNA的对照)也有扩增，这表明EN型mastermix中有DNA污染。而使用DF型的mastermix扩增结果中，NTC没有任何扩增，表明DF型的mastermix不存在DNA污染。关于PCR mastermix中含有背景DNA导致测量结果假阳性,之前已有报道[8,9]，因此，在选择PCR mastermix对目的基因进行定量分析时应先考察所使用的PCR试剂中是否有DNA污染，进而排除背景DNA的污染，保证定量结果的准确性。

此外，使用DF型的mastermix扩增的结果中，超螺旋质粒(O66)扩增的平均Cq值(24.20±0.08)和线性质粒(E37)扩增的平均Cq值(24.32±0.13)非常接近，推测2种样品的浓度相近。而使用EN型的mastermix扩增中，2种不同构象的质粒扩增的Cq值相差较大，表现为对超螺旋DNA扩增的平均Cq值(26.19±0.03)大于线性化质粒扩增的平均Cq值(24.12±0.04)，而线性化质粒扩增的平均Cq值与使用DF型mastermix扩增的一

致，推测是由于超螺旋的结构使得DNA聚合酶与目标模板结合较为困难导致延迟扩增，进而表现为扩增的Cq值较大，这一发现与文献[7]的报道一致。而DF型的mastermix中可能含有一些有利于超螺旋DNA解旋或帮助解链的成分，从而表现为浓度近似的超螺旋质粒和线性质粒样品在扩增中的Cq值没有明显差异。

3.3 DNA模板稀释倍数的确定

图2为对不同稀释倍数以及酶切和非酶切处理的样品的分析结果。从结果看，没有稀释(E37)和稀释2倍(E37×2)的线性质粒样品采用Assay3和Assay4这2个方法定量结果没有显著差异(Assay3，P=0.88；Assay4，P=0.48)。表明2个浓度均在数字PCR准确定量的线性范围内，因此对于线性质粒样品可以不进行稀释或者稀释2倍进行后续定量。但考虑到可能由于不同样品瓶内的样品浓度会有差异，如果其他样品瓶内的浓度偏高而不进行稀释就会使得阳性分子数不在理想的范围内。因此选择稀释2倍进行后续样品的定量分析。

稀释2倍的样品采用Assay3定量的结果与采用Assay4定量的结果之间没有显著差异(P=0.16)，而没有进行稀释的样品采用Assay3定量的结果与采用Assay4定量的结果之间具有显著差异(P=0.01)，这可能是由于2种方法的扩增效率或探针标记荧光不同导致。仔细分析结果是由于荧光标记基团的差异导致，且发现Fam荧光在BioMark数字PCR仪上的响应较差。因此对最终提交的样品的定量结果只选用了Hex荧光标记方法的测定结果。

对于超螺旋质粒，没有稀释(O66)和稀释2倍(O66×2)的样品采用Assay3和Assay4

定量的结果均没有显著差异(Assay3，P=0.26；Assay4，P=0.92)。因此对于超螺旋质粒样品可选择不稀释或者稀释2倍进行后续定量。2个Assay之间相互比较时，没有进行稀释和稀释2倍的样品定量的结果之间也没有显著差异(O66，P=0.40；O66×2，P=0.20)。

酶切(O66-E)与非酶切对照(O66-CK)相比，采用2个Assay定量的结果均无显著差异(Assay3，P=0.08；Assay4，P=0.16)，这表明利用该扩增体系进行数字PCR定量分析时无需对超螺旋质粒进行酶切，进而可减少不确定度的来源。

3.4 单重PCR和双重PCR测定结果比较

在确定好上样浓度和对超螺旋质粒是否做酶切处理后，利用单重PCR(单独采用assay3或assay4)分析其余的样品，定量结果见图3。经过T检验发现2个Assay对所有样品定量结果均无显著差异，但O46样品的浓度与其余3个超螺旋质粒样品的浓度相比显著偏低，经过格拉布斯检验，该瓶为离群值，且经过后续多次测定，此样品浓度均显著偏低，因此在计算最终结果时将其剔除。虽然2个Assay所测定的结果无统计学意义差别，但2个PCR方法的测定结果最大相差9.3%(对E68样品的定量)。由于在进行PCR时，DNA样品的加入与引物、探针和PCR mastermix的混合是经过天平称量的，所以2个扩增体系中DNA样品的稀释倍数是确定的，而计算结果时已经考虑了DNA的稀释倍数，因此单重PCR中，2个PCR方法定量结果的差异不是由于各自加入的DNA量不同所致，推测是由2个PCR方法在扩增效率上有差异。

为避免任何一种方法的测定结果有偏差，又采用双重PCR对这些样品进行定量分析，以排除是否由于单独进行PCR导致了2个PCR方法定量的差异。使用Assay3和

Assay4进行双重PCR的测定结果见图4，经分析发现，与单重PCR测定结果相比，双重PCR中2个方法对线性质粒和超螺旋质粒的定量结果均没有显著差异。但双重PCR反应中，分别以Assay3和Assay4对同一样品的浓度进行计算，结果偏差与单重PCR相比降低至5%以内。可见采用双重PCR扩增可以使2种PCR方法的扩增差异降低。但分析标记方法的测定结果发现，Fam荧光信号在数字PCR仪器上响应较差，导致整体的扩增曲线质量不高，基线的调节非常关键，基线的微调均会使得测定结果发生明显变化。所以最终使用Hex标记的2个方法进行单重PCR定量。

3.5 DNA拷贝浓度测量结果

经过上述一系列的分析后，最终选择Hex标记的2个方法的测定结果作为未知样品浓度。根据式(2)计算样品的最终浓度(copies/mg)，还需测定PCR体系中混合液体的密度，通过密度将测量结果单位由copies/μL换算为copies/mg，经过测定，线性质粒反应液的密度为1.000 3 g/cm3，超螺旋质粒反应液的密度为1.000 5 g/cm3，最终用来计算样品浓度并提交的原始数据见表2。经计算，线性质粒样品的浓度为8 064 copies/mg，相对标准偏差为6.5%，超螺旋质粒样品的浓度为8 675 copies/mg，相对标准偏差为5.4%。

3.6 测量结果不确定度评定

上述测量结果的不确定度因素包括测量重复性、单反应室体积、密度和稀释因子[7,10]，不确定的分量见表3。取包含因子k=2，95%的置信概率，线性化质粒的相对扩展不确定度为7.62%，超螺旋质粒样品的相对扩展不确定度为7.92%。最终提交主导实

验室的结果为线性质粒：(8.06±0.55)×103copies/mg，超螺旋质粒：(8.68±0.62)×103 copies/mg。

对于线性质粒，NIM的测量结果为(8.06±0.55)×103copies/mg，NIM提交的结果和主导实验室结果共同作为比对的中位值用于计算该国际比对的参考值，国际比对的参考值为(7.97±0.82)×103copies/mg[11]，表明本文所建立的数字PCR方法可以准确地测定样品的浓度。对于超螺旋质粒样品，并不是所有的参加实验室均成功地测定了样品的浓度，NIM的测量结果与主导实验室采用同位素稀释质谱法和单分子计数法的测量结果非常接近，后续双方又进行了双边比对[12]，结果表明我们建立的数字PCR方法也可以成功地对超螺旋质粒DNA含量进行测量，其测量结果与单分子计数法的测量结果具有可比性。

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