一、实验名称：
重组DNA技术
二、实验目的：
1. 了解掌握DNA重组技术理论基础；
2. 掌握质粒载体、外源DNA的准备、酶切、连接技术方法； 3. 掌握连接产物的转化方法及操作； 4. 掌握阳性重组体的的鉴定和筛选方法；
三、实验原理:
1. 重组DNA技术
重组DNA技术是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新特性的生物类型的技术。它主要包括以下几个步骤：
①目的基因的获取：主要有化学合成、PCR、基因组文库、cDNA文库构建等。cDNA文库是以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有cDNA信息，总称cDNA文库 。常用于筛选编码蛋白质的结构基因。基因组DNA文库是利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有基因组DNA信息，因此称为基因组DNA文库。
②基因载体的选择与构建：常用载体有质粒、噬菌体、病毒DNA等。分为克隆载体和表达载体。克隆载体：用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变等。表达载体：用于在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物。选择好的载体与目的基因利用限制性内切酶切割成合适片段。
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③目的基因与载体的拼接：通过粘性末端连接法（同源互补粘性末端连接、非同源互补粘性末端连接）、平端连接、人工接头连接、同聚物接尾、经部分补平的不匹配末端的连接等将目的基因与载体进行连接。
④重组DNA分子导入受体细胞：将连接有目的DNA的载体导入宿主细胞，主要有以下几种方法：a、转化：将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞(常用大肠杆菌)，并使其获得新的表型的过程。b、转染：将外源DNA导入真核细胞的过程。c、感染：以λ噬菌体、柯斯质粒和病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。
⑤重组体的筛选：可通过遗传标记如抗药性标志选择、营养缺陷型的互补筛选法及分子标记（PCR、分子杂交）等直接筛选或是根据免疫化学法、酶联免疫检测法等进行间接筛选。
⑥无性繁殖转化子(含重组分子的受体细胞) ⑦目的基因的表达
2、质粒酶切及鉴定原理
限制性内切酶是一种工具酶，其特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸序列的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA双链，形成一定长度的DNA序列。根据限制性内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类， II型限制性内切酶只需要二价镁离子的激活，酶在其识别序列内切割双链DNA，产生的各种DNA片段具有相同的末端结构，而且大多数的II型酶可提供粘性未端，有利于片段再连接，限制性内切酶对环状质粒DNA产生的酶切片段数与切口数一致。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切口的数目;从片段迁移率可判断酶切片段大小。用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子大小。本实验采用的限制性内切酶是Bam HI和Hind III。
对于DNA回收，回收的目的是为了纯化提取的质粒，以用于以后的分子杂交、重组质粒的构建、序列分析等。目前常用的回收技术有：柱纯化回收法、电洗脱法、低熔点琼脂糖凝胶法、DEAE滤膜插片法等，其中柱纯化回收法、电
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洗脱法，经济节省，操作方便，对DNA回收效果好。本实验采用试剂盒回收（柱纯化回收法），其原理是采用凝胶裂解液融化凝胶，采用特殊的收集管收集DNA后，漂洗液洗脱杂质，最后用洗脱液洗出DNA。
四、主要实验仪器：不同规格移液器、EP管、常规电泳仪、紫外灯、恒温水
浴箱、常规台式离心机、恒温孵箱、CP3吸附柱、收集管、培养皿、酒精灯、玻璃涂布棒等。
五、主要实验试剂：
1. 酶切相关试剂：pUC18DNA、λDNA（TIANGEN, MD202）、Hind III（Thermo,
ER0501）、Buffer R (10X) （Thermo, BR5）、BamHI（Thermo, ER0051）、BamHI-Lsp1109I Buffer (10X)（Thermo, B57）、pUC18-mir203 质粒DNA （老师提供）。
2.电泳相关试剂：琼脂糖、GoldView、1kb DNA Ladder（TIANGEN， MD111）、
DNA电泳loading buffer（6X）（TIANGEN, RT201-01），电泳缓冲液。
3、凝胶DNA回收：小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（庄盟国际生物，ZP202）。 4. 重组体构建相关试剂：T4 DNA连接酶(Thermo, EL0014)、10X T4 DNA
连接buffer( Fermentas, 00044933)。
5. 转化相关试剂：感受态细胞（本实验用感受态细胞DH5α从公司购买）、
LB培养基（老师提供）、含Amp琼脂糖平皿（老师提供）、质粒小量提取试剂盒（庄盟国际生物，ZP101）、ddH2O等。
六、实验步骤：
1. 载体pUC18和目的DNA酶切
（1）质粒DNA酶切反应体系： 试剂 pUC18DNA (5ug) 10×buffer Hind Ⅲ (15U) 体积 (ul) 2.5 2 5 页眉内容
ddH2O total 10.5 20 反应条件：37℃恒温水浴， 2hr；室温下放置等待连接。
（2）目的DNA酶切反应体系：
试剂 λDNA(5ug) 10×buffer Hind III(9U) ddH2O total 反应条件：37℃恒温水浴， 2hr；
体积 (ul) 10 2 3 5 20 （3）质粒载体双酶切反应体系：
试剂 pUC18-mir203 质粒DNA(4μg) 10×buffer Hind III(9U) Bam HI ddH2O total 反应条件：37℃恒温水浴， 2hr；
根据以上反应体系配制好后，瞬时离心后置于37℃恒温水浴锅中反应。
体积 (ul) 25 5 2 1 17 50 2. 目的DNA酶切片段电泳鉴定
（1） 配制1%琼脂糖凝胶：称取0.5克琼脂糖，置于锥形瓶内，加入50ml
1×TAE，瓶口用保鲜膜封盖，在微波炉中加热直至琼脂糖全部溶解，得到1 %琼脂糖凝胶液，待其冷却至65℃左右，加入2.5 μL GoldView。小心混匀并倒在制胶槽中，控制灌胶速度，使胶液缓慢展开，避免产生气泡，待胶凝固完全后，轻轻拔出梳子。将凝胶放入电泳槽中，加入恰好没过胶面1mm深的足够电泳缓
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冲液，准备电泳。
（2） 电泳：取20uL酶切后产物，加入4uL DNA电泳loading buffer混匀，
上样20uL。恒压90V电泳40-60min。
（3） 紫外灯下观察结果并切胶用于后续试验。
3.目的DNA凝胶条带切割及目的DNA回收
根据试剂盒说明书操作
（1）将单一的目的 DNA 条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量，约0.3g。
（2）向胶块中加入3倍体积溶胶液（900 µl），55℃,水浴10分钟左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
（3）将上一步所得溶液加入一个吸附柱中 （吸附柱放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g )离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。 （4）向吸附柱中加入 600 μl 漂洗液 W2 （使用前加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。 （5）向吸附柱中加入 500 μl 漂洗液 W2，12,000 rpm (~13,400×g )离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
（6）将吸附柱放入收集管中，12,000 rpm (~13,400×g )离心 2 分钟，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。
（7）将吸附柱放入一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μl 的洗脱缓冲液 TE，12,000 rpm (~13,400×g )离心 1 分钟，收集 DNA 溶液。
4. 连接目的DNA和酶切后的质粒DNA
反应体系： 试剂 pUC18质粒载体 目的DNA T4 DNA连接酶 10×buffer ddH2O 体积 (ul) 2 2 1 1 4 页眉内容
total 10 配置好以上反应体系，瞬离混匀后，室温，过夜。
5. 转化
（1）-70℃冰箱取出感受态细胞DH5α，冰浴中融化。
（2）在1.5ml Ep管中加入50μlDH5α感受态细胞和2μl的DNA溶液，温和混匀后置于冰上30min。
（3）将菌液再置于42℃水浴中热激90s后冰浴2min。
（4）然后加入900ul LB液体培养基，置于37℃恒温摇床上复苏3h（160rpm）。 （5）菌液4000r/min离心2敏后。留下200uL上清液将菌体打散，并均匀涂布在预先准备好的含Amp的LB固体培养皿上，15min后，待菌液被培养基吸收后，倒置放于37℃培养箱中培养过夜。
（6）待细菌生长16h左右时，LB培养基表面长出肉眼可见的菌落，此时用灭菌后的枪头挑取单一细菌克隆，置于含Amp的LB液体培养基（15mL）离心管，37℃恒温摇床过夜培养（160rpm）。
6. 阳性重组子的克隆
待细菌生长16h左右时，LB培养基表面长出肉眼可见的菌落，此时用灭菌后的枪头挑取单一细菌克隆（以小枪头挑轻触菌落即可），连同枪头一起放入盛约3ml的LB培养基的15ml规格离心管中，37℃恒温摇床过夜培养（160rpm）。
7. 阳性重组子的酶切鉴定
（1）质粒提取（根据试剂盒说明书操作）
a. 收集菌体：取 1.5 ml 过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机， 12,000 rpm (~13,400×g ) 离心 1 分钟，保留沉淀，尽量吸除上清。 b. 重悬菌体：向留有菌体沉淀的离心管中加入 250 μl 溶液 1（使用前加入 RNaseA），用移液枪吹打彻底悬浮细菌沉淀。
c. 裂解菌体：向离心管中加入 250 μl 溶液 2，温和地上下翻转 6－8 次使菌体 充分裂解。 注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组 DNA，造成提取的质粒 中混有基因组 DNA 片断。
d. 沉淀除杂：向离心管中加入 350 μl 溶液 3，立即温和地上下翻转 6–8 次，
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充 分混匀，即出现白色絮状沉淀。12,000 rpm (~13,400×g )离心 10 分钟，此 时在离心管底部形成沉淀。
e. 将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱中 （吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000 rpm (~13,400×g) 离心 30-60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。 注意：溶液 3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小 白色沉淀，可再次离心后取上清。 f. 向吸附柱中加入 700 μl 漂洗液 W2 （请检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )离心 30-60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集 管中。
g. 向吸附柱中加入 500 μl 漂洗液 W2，12,000 rpm (~13,400×g )离心 30-60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
h. 将吸附柱放入收集管中, 12,000 rpm (~13,400×g) 离心 2 分钟，目的是将吸 附柱中残余的漂洗液去除。 注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR 等）实验。为 确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱开盖，置于室温放置数分 钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
i. 将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加 60-100 μl
洗 脱缓冲液 TE，室温放置 2 分钟，12,000 rpm (~13,400×g) 离心 1 分钟将质 粒溶液收集到离心管中。
j. 对提取的重组质粒进行酶切鉴定。（条件允许可送公司测序）
（2）重组质粒酶切
酶切反应体系： 试剂 pUC18DNA+λDNA片段连接产物 10×buffer Hind III(15U) ddH2O total 反应条件：37℃恒温水浴，2.5hr
体积 (ul) 2.5 2 5 10.5 20 页眉内容
（3）电泳进行鉴定
将上步所得酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，上样前加6ul loading buffer，电泳条件：90V，40-60min。紫外灯下观察电泳结果。
七．实验结果及分析 1. 质粒及目的基因酶切结果
如图所示，编号1—14上样孔道依次为：maker，pUC18质粒酶切，pUC18-mir203 质粒双酶切，pUC18质粒酶切，λDNA酶切，pUC18质粒酶切，pUC18-mir203 质粒双酶切，maker，λDNA酶切，pUC18质粒酶切，pUC18质粒酶切，pUC18-mir203 质粒双酶切，pUC18-mir203 质粒双酶切，pUC18质粒酶切。
结果分析：(1)首先四组同学进行了双酶切实验，但是电泳后紫外灯下观察均未出现条带。可能原因是质粒提取时出现问题，未提取到质粒，或是长时间保存，降解。(2)根据说明书pUC18质粒大小为2686bp，本实验中酶切后所有组均出现两条带，可能是因为酶切不充分。后续实验可以考虑延长酶切时间，或是优化反应体系。此外也可能是试剂污染。此外由于跑胶不充分，maker选用不合适，所以无法判断其分子量。（3）λDNA酶切后产生多条条带，根据说明书，酶切后产生564bp，2027bp，2322bp，4361bp，6557bp，9416bp，23130bp条带。但是本实验中选用maker不合适，所以不能较准确地判断条带大小。
2. 目的DNA凝胶条带切割及目的DNA回收
在紫外灯下切取第四泳道pUC18质粒酶切后较小分子量条带，重0.3g，切取第五泳道λDNA酶切后较大分子量条带，重0.28g。根据琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书提取DNA。
3. 重组体转化及筛选
如左图所示：转化后的DH5α涂布于含Amp的琼脂糖平皿，37℃培养24小时后，在培养皿上可见阳性单菌落。
在本实验中解融后的DH5α涂布于琼脂糖平皿中，37℃培养24小时后，如右图所示，培养皿底长满了菌落，仅在边缘存在少量的单菌落。说明DH5α活
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力良好。实验中还需设置一个阴性对照孔，即将DH5α涂布于含Amp的琼脂糖平皿中。以后实验中需完善。
挑取单克隆到含Amp的液体LB培养基中， 37℃培养过夜后，可见培养基变浑浊，说明细菌得到扩增。
4. 重组质粒的提取、酶切鉴定
提取质粒后进行琼脂糖凝胶电泳，结果如左图所示，可见只有第二泳道和第六泳道有条带，但存在严重的拖尾现象，可能是有大量大肠杆菌死亡，这可能是因为37℃培养16小时后，未避免过量扩增及实验所需，所以将其置于4℃冰箱中过夜，待第二天提取质粒造成的。 第五泳道为DH5α涂布于LB培养皿中所得单菌落扩增后提取的质粒，未，其结果与第二和第六泳道不同。其余泳道未见条带，这可能是质粒提取操作不当，未提取到质粒。
提取后的质粒酶切后进行电泳，结果如右图所示（泳道8-14）。泳道11-14，误将maker当loading buffer使用，导致多条条带出现。泳道9酶切后只有一条带，所以不是重组体，可能是一个空质粒。
从整个实验最后的结果来看，未得到阳性重组体，所以实验失败。实验过程中存在较多细节，由于前期未充分了解预习该实验，导致实验过程中出现较多问题。但是熟悉了整个流程，在后期实验结果的整理过程中又进一步了解了该实验，对自己以后的实验及学习有很大帮助。
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