生物芯片技术在新药筛选中的应用

系列诊断芯片已开始进入市场。

1.3　检测细菌毒素和毒力因子　葡萄球菌肠毒素(SES)是由金黄色葡萄球菌产生的,可引起急性胃肠炎,目前已知有17种血清型包括SEA到SER(无SEF),其编码基因ent的基因序列在各型之间比对发现也存在保守区和可变区,Sergeev等根据ent基因制备微阵列,可同时检测多种ent基因型。

大肠埃希菌是肠道的正常菌群,通常不致病,但在获得了毒力基因的决定簇后成为致病菌,其毒力基因是研究确定大肠埃希菌致病性的理想的靶基因,Bekal等建立了一种毒力因子微阵列技术,将所有已知的91个毒力基因(包括不耐热毒素LT,耐热毒素ST,志贺毒素Stx1和Stx2,7种溶血素低度病变(CINI),高危险型HPV亦有多种,与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变(CINÊ/Ë)的发生相关,尤其是HPV16和18

型。因此正确确定HPV的型别对于寻找肿瘤的病因及肿瘤的预问世,并有对其应用评价的相关报道。

2.4　检测流感病毒　流感病毒传染性较强,流行的毒株常发生称为漂移和转变的变异,表面血凝素(HA)及神经氨酸酶(NA)两种结构决定了流感病毒的亚型,根据HA、NA的基因设计探针建立特异性寡核苷酸微阵列,可用于检测流感病毒并进行分型。

3　在多种病原体平行检测中的应用

防有重要意义。目前检测HPV的寡核苷酸微阵列的试剂盒已经

Hly、Ehx、East1、STb、EspA、EspB、EspC,3种细胞毒坏死因子,24种黏附因子,分泌系统Etp,荚膜抗原,菌体抗原,鞭毛抗原,透明质酸酶等)进行扩增点在玻片上制备毒力基因微阵列,为毒力基因检测及菌株亚型的确定提供了强有力的技术手段。蛋白芯片的出现,为在蛋白质水平平行检测毒素抗体或抗原提供了方便条件,Rucker等建立了同时检测多种毒素的抗体微阵列,包括霍乱毒素B亚单位、白喉毒素、炭疽致死因子和保护性抗原、金黄色葡萄球菌肠毒素B及破伤风毒素C片段,其检测限度可与免疫夹心法相媲美。

2　在病毒检测中的应用

2.1　检测艾滋病病毒(HIV)　早在1996年Kozal等人就开始与Affymetrix公司合作研制基因芯片,对HIV-1B亚型中的逆转录酶和蛋白酶基因的多态性进行了分析,这也是基因芯片第一次用于临床。1998年Kimizuka和Affymetrix公司合作生产新一代诊断试剂盒,利用RMS实验室的PCR扩增技术和DNA芯片技术检测艾滋病患者的HIV耐药反应。根据HIV对主要药物(病毒逆转录酶RT和蛋白酶PR的抑制剂)产生的耐药突变位点,将这些基因突变部位的全部序列构建基因芯片,则可进行快速而有针对性的检测。目前,用于HIV-1的测序分型及多态性分析的芯片试剂盒已经问世。2.2　检测肝炎病毒(HCV)　Livache用寡核苷酸芯片研究了HCV的基因型,是将HCV基因探针固定于硅片上形成微电极矩阵,以生物素标记的待测基因和芯片上的探针杂交,结果显示DNA芯片在HCV检测中具有高敏感性和高分辨率,这是生物芯片第一次运用于检测HCV。Kawaguchi等将DNA微阵列应用于HBV-DNA检测,对25份HBV-DNA阳性血清的检测结果显示存在明显的相关性(r=0.89)。

拉米夫定是一种有效的抗乙肝病毒(HBV)的药物,但容易产生病毒的耐药性突变,从而诱导HBV产生耐药株,其耐药的原因是在HBV-DNA逆转录酶的氨基酸发生替代,对引起变异的基因设计探针、制备微阵列,可对临床标本进行检测,判断耐药性的形成。Jang等根据HBV多聚酶基因设计的耐药突变寡核苷酸芯片是检测HBV耐药突变的一种可靠和有用的工具。

2.3　检测人类乳头状瘤病毒　人类乳头状瘤病毒(HPV)可引起人类良性的肿瘤、疣及宫颈癌,目前已经确定的HPV型别大约有80余种,约20种与肿瘤相关,依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低分为低危险型别和高危险型别HPV,部分低危险型别HPV常引起外生殖器湿疣等良性病变及宫颈上皮内

鉴于生物芯片的平行性特点,许多研究者尝试用其进行多种病毒的同时检测,如Wang等根据多种呼吸道病毒的基因序列设计了长片段(70nt)寡核苷酸探针微阵列,用病毒感染的细胞培养物检测鉴定多种病毒,包括呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒、人鼻病毒、Kaposi肉瘤相关疱疹病毒,并能区分病毒的亚型。

Duburcq等建立了一种新的肽—蛋白微阵列同时检测HCV、HBV、HIV、梅毒(Tp)的病原体感染。我国丁亚平等人建立了一种蛋白微阵列,同时检测血清中HIV、HCV及Tp

抗体,与ELISA试剂盒,具有高度的符合率。Perrin等尝试将寡核苷酸微阵列与蛋白微阵列结合,同时检测HBV、HCV、HIV的DNA和抗体,取得了初步的结果。

Bacarese-Hamilton等制备了抗原微阵列,可检测血清中多种病原体包括单纯疱疹病毒1和2型、巨细胞病毒、风疹病毒、鼠弓形虫的抗体,与ELISA的符合率超过80%。

理论上,将各种病原微生物的特异序列制成探针,有序地点阵到基片上再与处理后的样本进行杂交,一次就可检测出多种病原微生物。我国军科院的崔红等人以16SrDNA为对象,建立了一种能在未知标本中快速检测6种立克次体的微

阵列技术,包括伯氏考克斯体、汉氏巴尔通体、恙虫病东方体、普氏立克次体、立氏立克次体以及犬埃立克体。Liang等建立博氏疏螺旋体脂蛋白基因的DNA微阵列,成功检测了引起LYME病的博氏疏螺旋体的脂蛋白基因。

生物芯片技术在新药筛选中的应用

潘继红

(山东省医药生物技术研究中心,山东济南250062)

　　生物芯片在药物筛选方面展现了其广泛的应用前景,使药物筛选的速度大大加快。

1　在药物靶标筛选中的应用

1.1　基因芯片　可以平行测定几千个基因的表达方式,以发现有意义的靶,也可用来监测药物治疗过程中基因表达的变化,还可以直接筛选特定的基因文库以寻找药物作用的靶点。

人类基因组图谱的绘制成功,使人们可以对所有基因加以研究,以确定其功能,所有的基因都有可能作为药物靶。而基因芯片有助于我们快速、准确地鉴别和确认药物靶。例如,组织

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山东医药2005年第45卷第26期

蛋白酶K是一种新的由EST文库中鉴别的半胱氨酸蛋白酶,在破骨细胞中特异表达,抑制组织蛋白酶K,可能干扰破骨细胞的功能并防止骨质疏松症。为证实这一假设,必须在mRNA水平和蛋白质水平仔细分析表达数据。原位杂交证明其在破骨细胞内有高水平表达,而免疫组织化学证明组织蛋白酶K蛋白出现在骨被分解蛋白酶降解的小坑处。而这一区域正是发生骨蛋白酶解的区域,用基因芯片可以较容易的进行分析。美国的一个研究小组利用芯片技术研究患者对抗高血压药物的敏感性,在1000多个高血压相关基因中发现血管紧张素转换酶2(ACE2)为药敏的主要调控蛋白,并在模建三维结构的基础上设计了新的ACE2抑制剂,仅用不到2a的时进行药物相互作用的筛选和翻译后蛋白质修饰的检测。蛋白质芯片的灵敏性高,对生物样品的要求较低,可以直接利用生物材料(血样、尿样、细胞及组织等)进行检测;其高通量特点加快了生物靶点的发现和确认速度。CiphergenBiosystems公司利用蛋白质芯片3d之内即发现了6种潜在的前列腺癌生

物学标志物。

蛋白质芯片除了在发现药物靶点方面有突出作用外,在药物开发过程中也有重要作用。应用蛋白质芯片与待筛选的样品相互作用,寻找能够与特异靶点结合的化合物,为开发新药奠定基础。基于蛋白质芯片的研究成果,已有人将蛋白质芯片应用于高通量药物筛选,获取有益信息,降低药物开发的风间就将其投入É期临床试验。

基因芯片最具吸引力的应用是疾病中的差异基因表达研究。比较患病组织及正常组织或细胞中数以千计的基因表达谱有可能得到许多潜在的药物作用靶标。基因活性的上调或下调都会引起病理生理学的变化并导致疾病。尽管治疗疾病最好能找到引起疾病的基因作为靶标,但干扰诱发疾病的基因产物也可缓解症状。最近有人用基因芯片分析了风湿组织内在炎症中起重要作用的大约100个基因的表达情况,结果发现编码IL-6、几种基质金属蛋白酶的基因都明显上调。

比较药物处理前后组织或细胞内基因表达的变化情况同样能提供许多有价值的信息。通过用药前后基因表达谱的变化找出靶基因及受靶基因调控的基因是否恢复到正常状态,并研究是否影响其他基因的表达从而带来毒副作用。首先,经药物处理后表达明显改变的基因往往与发病过程及药物作用途径密切相关,很可能是药物作用的靶点或继发事件,可作为进一步药物筛选的靶标或对已有的靶标进行验证;药物处理后基因表达的改变对药物作用机制的研究有一定的提示作用;最后,观察药物处理后细胞基因表达谱的改变可大致估计药物的毒性及代谢特点等,有利于下一步工作的进行。

应用基因芯片还可以直接筛选特定的基因文库以寻找药物作用的靶点。国外研究组构建了一个酵母基因文库,每一株酵母都有一个特定的基因呈单倍体状态,对应的位置上设置了一个遗传标记,该标记可被基因芯片所识别,通过比较药物作用前后芯片检测整个文库的结果,可获得药物作用的靶基因。1.2　蛋白质芯片　能同时分析上千种蛋白质与生物分子的作用情况(酶-底物、抗体-抗原、配体-受体、蛋白质-核酸或小分子),在药物和蛋白质之间架起了一座桥梁。与DNA芯片相比,蛋白质芯片是对生命活动的执行者蛋白质进行研究,不仅能为药物的应用奠定坚实的理论基础,还能为药物的进一步开发和设计提供理论指导。目前,国外几乎所有规模较大的制药公司都不同程度的采用了芯片技术,减少了动物实验,以促进创新药物的研究与开发。主要研究途径包括:直接筛选特定的蛋白质组以寻找药物作用靶点,检测用药前后蛋白质的变化找出靶蛋白,比较患病及正常组织或细胞中蛋白质改变得到潜在的药物靶点。

耶鲁大学研究小组用制备的酵母蛋白质组芯片,发现了许多新钙调蛋白和磷脂相关蛋白,揭示了一个共同的假定结合位点。这种高通量的生物技术可用于制备4万种人体蛋白,

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险,提高成功率。

2　在分子药理学与毒理学研究中的应用

生物芯片是一种潜在的研究药物作用机制的有效工具。最近有两项研究是在以酵母为模型的系统中用高密度芯片来检测药物对基因表达的影响。生物芯片有助于分析代谢途径如细胞色素P450解毒酶的诱导,还可用于预测不良反应如毒性的研究。

慢性毒性和副作用往往涉及基因或基因表达的改变。基因芯片技术应用于药物毒副作用的研究也将改变传统的毒理学研究方式,减少大量的动物实验,提高用药的安全性。生物芯片技术使得药物筛选、靶基因鉴别和新药测试的速度大大提高,甚至可能在几天内确诊某种药物是否会导致遗传突变或造成其他危险。

毒理基因组学是基因组学和生物信息学的一个分支,它从基因组全局上研究毒物作用与基因表达的相互影响,而生物芯片是毒理基因组学研究的有力工具。它可以应用于毒理学中的一些重要问题,如毒作用机制、剂量反应关系等。Sato-H等报导了柴油机燃烧废气粒子对于实验动物肺癌的诱导作用,其用cDNA微阵列检测大鼠肺中癌基因及相关基因的表达,用NorthernBlot验证结果。结果,A-raf基因和增生细胞

核抗原(PCNA)mRNA被诱导;证实A-raf基因和PCNA在大鼠肺癌变中起作用。

最近,Bartosiewicz-M等利用微阵列检测B-萘黄酮引起的基因表达的变化。应用B-萘黄酮8h后大鼠肝脏中的细胞色素P4501A1和1A2上调的量最大。用芯片检测基因表达能检测到CYP1A2明显的上调的B-萘黄酮剂量是0.62mg/kg,而用NorthernBlot为1.2mg/kg。斑点与斑点、芯片与芯片之间的变异系数<15%,低于动物体内的变异(18%～60%)。Af-shari-CA等用cDNA芯片检测了致癌物质、毒性及药物安全性评价。

3　在中药物种鉴定中的应用

传统的中药物种通过外观来鉴定,随着人们对中药基因了解的增多,近年来分子生物学的一些方法开始用于中药分类学研究,其原理是基于任何一个生物个体,不受发育阶段影响,其不同组织器官部位以至细胞都具备相同的遗传信息。这些方法中以基因芯片技术最具有潜力。目前已有学者开始对道地与非道地药材如贝母、金银花等的DNA序列进行研究,分离特异核苷酸序列作为探针并制备了DNA芯片。