细胞库建立标准

细胞库成立概略

一、对细胞库细胞基质总的要求

( 一 ) 细胞系／株历史资料

1．细胞系／株根源资料

应拥有细胞系／株根源的有关资料，如细胞系／株制备机构的名称，细胞系

／株根源的种属、年纪、性别和健康状况的资料。这些资料最好从细胞根源实验室获取，也可引用正式发布文件。

人源细胞系／株须拥有细胞系／株的组织或器官根源、种族及地区根源、年

纪、性别及生理状况的有关资料。动物根源的细胞系／株须拥有动物种属、种系、饲养条件、组织或器官根源、地区根源、年纪、性别、病原体检测结果及供体的一般生理状况的有关资料。

2．细胞系／株培育历史的资料

应拥有细胞分别方法、 细胞体外培育过程及成立细胞系／株过程的有关资料，

包含所使用的物理、化学或生物学手段，能否有外源增添序列，以及细胞生长特点、生长液成分、选择细胞所进行的任何遗传操作或选择方法等。同时还应拥有细胞鉴

别、检定、内源及外源因子检测结果的有关资料。

应供给细胞培育液的详尽成分。如使用人或动物源成分， 如血清、 胰蛋白酶、解蛋白或其余生物学活性的物质，应拥有这些成分的根源、制备方法、质量控制、

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水

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检测结果和质量保证的有关资料

。

( 二 ) 细胞库的成立

细胞库的成立可为生物制品的生产供给已标定好的、

续稳固传代的细胞种子。

细胞质量同样的及能持

1．原资料的选择

成立细胞库的各样种类细胞的供体均应切合细胞库细胞的检定中有关规定。神经系统根源的细胞不得用于生物制品生产。

培育细胞用牛血清应根源于无牛脑海绵体脑病流行地

区的健康牛群，其质量

标准应切合规定 ( 附录 XIII D)

。 不得使用人血清作为细胞培育液。如需使用人血白蛋白，则须使用有同意文号

的合格制品。

消化细胞用胰蛋白酶应进行检测，证明其无细菌、真菌、支原体或病毒污染。

特别应检测胰蛋白酶根源的动物可能携带的病毒，如渺小病毒等。

用于生物制品生产的培育物中不得使用青霉素或β

- 内酰胺 ( β-Lactam) 类抗

生素。

2．细胞培育操作的要求

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细胞培育生产人员应按期检查身体。 在生产区内不得进行非生产制品用细胞或微生物的操作；在同一工作日进行细胞操作前，不得操作或接触有感染性的微生物或动物。

3．成立细胞库

细胞库为三级管理，即原始细胞库、主细胞库及工作细胞库。如为引进的细胞， 可采纳主细胞库和工作细胞库构成的二级细胞库管理。在某些特别状况下，也可使用主细胞库一级库，但须获取国务院药品监察管理部门的同意。

(1) 原始细胞库 (PCB)

由一个原始细胞集体发展成传代稳固的细胞集体，或经过克隆培育而形成的均一细胞集体，经过检定证明合用于生物制品生产或检定。在特定条件下，将必定数

量、成分均一的细胞悬液，定量平均分装于安瓿，于液氮或一 130℃以下冻存，即为原始细胞库，供成立主细胞库用。

(2) 主细胞库 (MCB)

取原始细胞库细胞，经过必定方式进行传代、增殖后平均混淆成一批，定量分 装，保留于液氮或一 130℃以下。这些细胞一定按其特定的质控要求进行全面检定，

所有合格后即为主细胞库，供成立工作细胞库用。

(3) 工作细胞库 (WCB)

工作细胞库的细胞由

MCB细胞传代扩增制成。 由 MCB的细胞经传代增殖， 达到一

定代次水平的细胞，归并后制成一批均质细胞悬液，定量分装于安瓿，保留于液氮

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或一 130℃以下备用，即为工作细胞库。冻存时细胞的传代水平须保证细胞复苏后传代增殖的细胞数目能知足生产一批或一个亚批制品。复苏后的传代的水平应不超

过同意的该细胞用于生产的最高限制代次。所制备的

WCB一定经检定合格，方可用

于生产。

4．细胞库的管理

每种细胞库均应分别成立台账，记录搁置地点、容器编号、分装及储存安瓿数目， 取用记录等。细胞库中的每

支细胞安瓿均应注明细胞系／株名、代次、安瓿号、

冻存日期，储存容器的编号等。

冻存的细胞存活率应在

90％以上。冻存后的细胞，应起码做一次复苏培育并连

续传代至衰老期，检查不一样传代水平的细胞生长状况。

主细胞库和工作细胞库分别寄存。 非生产用细胞应与生产用细胞严格分开寄存。

( 三 ) 细胞库细胞的检定

细胞检定主要包含以下几个方面： 细胞鉴识、 外源因子污染和内源因子的检测、 致瘤性检测等。必需时还须进行细胞染色体核型检查。这些检测内容关于

MCB细胞

和 WCB细胞均合用。

成立细胞库的实验室应起码进行一次

MCB细胞的全面检定，检定应包含：细胞

WCB后，

鉴识试验，细菌、真菌检查，支原体检查，外源病毒因子检查等。每次成立

均应按规定项目进行检定。

1．细胞鉴识试验

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新建细胞系／株、 细胞库 (MCB和 WCB)和生产结束时的细胞应进行鉴识试验， 以

确以为本细胞，无其余细胞的交错污染。细胞鉴识试验方法有多种，包含细胞遗传

检测 ( 如特点染色体标记 ) 、遗传标记检测 ( 如 DNA指纹图谱、 STR图谱、基因组二核苷重复序列 ) 、免疫学检测 ( 如组织相容性抗原、 种特异性抗血清 ) 和生物化学鉴识法 ( 好像工酶试验 ) 等。

可选此中一种或几种方法， 但均须经国家药品检定机构认同。

细胞表型特点与遗

传学特点相联合来判断，更有益于细胞鉴识。

2．细菌、真菌检查

取细胞培育上清液样品

3．支原体检查

取细胞培育上清液样品，应为阴性。

4．细胞内、外源病毒因子检查

应注意检查细胞系／株中能否有细胞根源物种中潜伏的可传染的病毒，

于操作带入的外源性病毒。对细胞进行病毒检查的种类及方法，须依据细胞的种属根源、组织根源及细胞特征决定。

以及由

(1) 细胞形态察看及红细胞吸附试验 ( 简称血吸附试验 )

取混淆瓶细胞样品，接种起码 6 个细胞培育瓶或培育皿，待细胞长成单层后换

保持液，连续培育两周。每天镜检细胞，细胞应保持正常形态特点。

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细胞起码培育 14 天后，分别取 1／ 3 细胞培育瓶或培育皿，用

0· 2％～ 0.5 ％

豚鼠红细胞和鸡红细胞混淆悬液进行血吸附试验。加入红细胞后置

4～ 8℃30 分钟， 而后置 20～ 25℃ 30 分钟，分别进行镜检，察看红细胞吸附状况，结果应均为阴性。

新鲜红细胞在 2～8℃保留不得超出 7 天，且溶液中不该含有钙离子或镁离子。

(2) 不一样细胞传代培育法检测病毒因子

自 MCB或 WCB根源的细胞，分别接种以下三种单层细胞，包含猴源细胞、人源 二倍体细胞和同种不一样批的细胞。 每种单层细胞接种起码 10000000 个活细胞或裂解细胞及其培育上清液， 每种细胞起码接种 2 瓶。接种样品量应占保持液的 1／ 4 以上，培育起码 14 天。

取培育 7 天的上清液各一瓶，分别接种于同种细胞培育，盲传一代，连续培育

7 天，察看细胞病变并进行细胞形态察看及红细胞吸附试验。

若待检细胞已知可支持人巨细胞病毒 (CMV)的生长，则应在接种人二倍体细胞后起码察看 28 天，应无细胞病变。同时，应进行血吸附病毒检测，应为阴性。

(3) 接种动物和鸡胚法检测病毒因子

MCB 细胞或 WCB细胞以及增殖到或超出生产用体外细胞龄限制代次的细胞，须 采纳动物体内接种法进行外源病毒因子检测。

采纳乳鼠、成鼠和鸡胚 ( 两组不一样日龄 )

80％以上动物或鸡胚健

合计 4 组，按表 1 所列方法进行试验和察看。如试验到期有

存，此试验成立，联合其余检测确立结果。

关于新建细胞系／株，还应接种豚鼠和家兔 ( 见表 1) 。豚鼠主要用于检查细胞内

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结核分枝杆菌，在注射前察看 4 周，结核菌素试验为阴性者方可用于试验。家兔主要用于检测猴根源细胞中能否存在 B 病毒污染，也可用兔肾细胞培育法取代。

动物组

要求 察看天数

数目 接种门路

结果判断

细胞浓度／个活细胞· ml ※ 接种细胞液量／

ml ·只 -

乳鼠

24 小时内 10(2 窝) 应健存

脑内 腹腔 >10 7 O ． 01 O ．1

21

成鼠

15 ～20g 10 脑内 腹腔 >2X10 6 O ． 5 21

应健存

鸡胚① 9～11 日龄

10 尿囊腔 >5X106 O ．2 3 ～4

尿 液 血 凝

试验阴性

鸡胚

5～6 日龄 10 卵黄囊 >2X106 O ．5 5 应存活

豚鼠

350～ 500g 5 腹腔 >4X10 5 5 ．O 42 应健存，解剖

无结核病变

家兔

1.5 ～

21

5

无异样，健存

皮下 皮内② >2X10s O

．1

× 10

(4) 逆转录病毒及其余内源性病毒或病毒核酸的检测

可采纳以下方法对

MCB细胞或 WCB细胞以及增殖到或超出生产用体外细胞龄限

制次的细胞进行逆转录病毒的检测。

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①逆转录酶活性测定采纳敏感的方法， 如产品加强的逆转录酶活性测定法 (PERT) 或其余检测逆转录酶的方法，检测细胞培育液上清中逆转录酶活性。

②透射电镜检查采集待检细胞，低速离心后，弃上清，积淀中应含有

1×10 7

个细胞，且细胞存活率应不低于

99％。在积淀中加入固定剂，于 4℃保留或直接包

埋后制备超薄切片，置于铜网上染色后透射电镜察看。

③感染性试验将待检细胞感染逆转录病毒敏感细胞，培育后检测。依据待检细胞的种属根源，须使用不一样的敏感细胞进行感染性试验。

这三种方法拥有不一样的检测特征及敏捷度，所以应采纳不一样的方法联合检测。若逆转录酶活性检测阳性时，建议进行透射电镜检查或感染性试验，以确证能否存

在感染性逆转录病毒颗粒。

小鼠根源和其余啮齿类根源的细胞系或其杂交瘤细胞系有可能携带潜伏的逆转录病毒。所以，关于人一鼠杂交瘤细胞系则应进行特异性逆转录病毒检测。如用于

单克隆抗体生产的小鼠细胞系，则可不检测特异性的逆转录病毒，但在生产工艺中应增添病毒灭活程序。

(5) 特别外源病毒因子的检测

应付 MCB细胞或 WCB细胞进行特别病毒的检测。检测病毒的种类应依据细胞系

／株种属、组织根源等确立。

如鼠源的细胞系，可采纳小鼠、大鼠和仓鼠抗体产生试验，检测其种特异病毒。

人源的细胞系／株，则应检测如人鼻咽癌病毒、人巨细胞病毒、人逆转录病毒、

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人乙型肝炎病毒、人丙型肝炎病毒。在某些状况下，也可能进行转变病毒的检测，如人乳头瘤病毒、腺病毒及人纯真疱疹病毒。这些病毒的检测可采纳适合的体外检测技术。

5．致瘤性检查

某些传代细胞系已证明拥有致瘤性，

如根源于啮齿类的细胞系

BHK21、CHO、C127

胞等，或细胞种类属致瘤性细胞，如杂交瘤细胞，则可不用做致瘤性检查。

某些传代细胞系已证明在必定代次内不拥有致瘤性，而超出某代次则拥有致瘤性，如 Vero 细胞，则一定进行致瘤性检查。

人上皮细胞系、人二倍体细胞株及所实用于活病毒疫苗生产的细胞系／株应进行致瘤性检查。此外，新建细胞系／株一定进行致瘤性检查。

在某些状况下，用于人体细胞治疗及基因治疗的细胞也须进行致瘤性检查。

将根源于 MCB细胞或 WCB细胞的增殖到或超出生产用体外细胞龄限制代次，再

进行致瘤性试验。

下述两种致肿瘤性试验方法可任选其一：

①裸鼠起码 10 只，将细胞悬浮于适当无血清培育基中，使细胞浓度为每

lml 含 5

× 10 7 个细胞，每只裸鼠皮下注射或肌内注射

O． 2ml；同时用 Hela 细胞或 HeP-2

细胞建立阳性比较，阳性比较组起码

10 只，每只注射 0．2ml 含 10 6 个细胞；可用

10 只，每只注射 0．2ml 含 10 7 个

人二倍体细胞株作为阴性比较，阴性比较组起码

细胞。

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②重生小鼠 (3 ～ 5 日龄 ) ，8～lOg 小鼠 10 只，在出生后第 0 天、 2 天、7 天和第

14 天，分别用 O． 1ml 抗胸腺血清 (ATS) 或球蛋白办理，而后同上每只皮下接种 个活细胞。并建立阳性比较组，比较组起码接种

10 只。 10 7

结果判断：

①按期察看并触摸注射部位有无结节形成，且形成的任何结节均应进行双向测

量并记录。

②阳性比较组起码有 9 只有进行性肿瘤生长时，试验视为有效。

③如试验组动物有进行性生长的结节或可疑病灶，

应察看起码 1～ 2 周；若出现

的结节在察看期内开始减退，则应在结节完整减退前，处死动物并进行解剖做病理及组织学检查。

④未发生结节的动物，多半动物应察看

21 天，剖检，此外多半动物应察看 12

周，进行病理检查，剖检接种部位，察看各淋奉承和各器官有无结节形成，若有思疑，进行病理组织检查，不该有转移瘤形成。

除上述体内法外，也可采纳软琼脂克隆形成试验或器官培育试验等体外法检测，特别合用于低代次时，动物体内无致瘤性的传代细胞系。

( 四 ) 生产用细胞培育

生产用原资料的选择和细胞操作环境，应切合本规程

\" 一、(二)细胞库的成立 \"

中有关规定。

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从冻存的 WCB中拿出一支或多支安瓿， 混淆后培育， 传至必定代次后供生产用。

其代次不得超出该细胞用于生产的最高限制代次。从 WCB拿出的细胞种子增殖的细胞不得再回冻保留或再用于生产。

体外培育细胞龄的计算

二倍体细胞龄以细胞集体倍增

(Population Doubling) 计算，以每个培育容器细

(1 ：2 分种率 )， 胞集体细胞数为基础，每增添一倍作为一世代，即一瓶细胞传二瓶

再长满瓶为一世代；一瓶传四瓶

(1 ： 4) 为二世代；一瓶传八瓶 (1 ： 8) 则为三世代。

2／3 内。

生产用细胞龄限制在细胞寿命限期的前

传代细胞系则以必定稀释倍数进行传代，每传一次为一代。

二、连续传代细胞系的特别要求

传代细胞系一般是由人或动物肿瘤组织或正常组织传代或转变而来，可悬浮

培育或采纳载体培育，能大规模生产。这些细胞可无穷传代，但到必定代次后，致

瘤性会加强。所以对生产用传代细胞系应进行严格检查。应按本规程

\" 一、( 三) 细胞

库细胞的检定 \" 的规定进行细胞库的检查。对生产过程中细胞培育的要求以下：

1．用于生产的细胞代次

用于生产的传代细胞系， 代次都有必定限制。 用于生物制品生产的细胞最高限制 代次，须经同意。

2 ．在生产末期进行外源病毒因子检测

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敌手病毒类制品，茬生产末期，比较细胞应按本规程

\" 一、 ( 三)4 ． (1) 细胞形态

察看及红细胞吸附试验 \" 规定进行血吸附病毒检查。 关于在不一样时间收会归并的培育物，应在每次采集时检测比较细胞培育物。

三、人二倍体细胞株的特别要求

新建的人二倍体细胞株一定拥有以下资料： 成立细胞株所用胎儿的胎龄和性别、停止妊娠的原由、 所用胎儿父亲母亲的年纪、 职业及健康优秀的证明 ( 医师出具的健康状态优秀、 无潜伏性传得病和遗传性疾患等证明 ) ，以及胎儿父系及母系三代应无显然遗传缺点疾病历史的书面检查资料。

人二倍体细胞株应在传代过程的初期，选择适合世代水平

(2 ～8 世代 ) 增殖出大

PCB之用，待所有检定

量细胞，定量分装后，置液氮中或一

130℃下冻存，供成立

合格后，即可正式定为

PCB，供制备 MCB用。

1．染色体检查及判断标准

新建人二倍体细胞株及其细胞库一定进行染色体检查。关于已建株的人二倍体 细胞株，如 WI-38、MRC-5、2BS、KMBl7 等，在成立 MCB时可不用进行细胞染色体检查。但如对细胞进行了遗传修饰，则须按新建细胞株进行染色体检查。

(1) 染色体检查

新细胞建株过程中，每 8～12 世代应做一次染色体检查，一株细胞整个生命期内连续培育过程中，起码应有 4 次染色体检查结果。

每次染色体检查，应起码随机取 1000 个分裂中期细胞，进行染色体数目、形态

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细胞库建立标准

和构造检查，并做记录以备复查。此中起码选择

50 个分裂中期细胞进行显微照相，

作出核型剖析，并应粗数

500 个分裂中期细胞，检查多倍体的发生率。

每次染色体检查，应从同一世代的不一样培育瓶中取细胞，混淆后进行再培育，制备染色体标本片。染色体片应长久保留，以备复查。

可用 G分带或 Q分带技术检查 50 此中期细胞染色体带型， 应用照相图片作出带

型剖析。

(2)

判断标准

对 1000 个和 500 此中期细胞标本异样率进行检查，合格的上限

( 可信限 90％

Poison

法)如表 2。

表 2 人二倍体细胞染色体剖析标准

┏━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━┓

┃

┃ 检查细胞数 ┃

┃

异 常 ┃ ┃

┃

┃

┃

100

┃

┃

1000 ┃ 500

┣━━━━━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━╋━━━━┫

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┃染色单体和染色体断裂┃47

┃26┃8┃ ┃构造异样

┃ 17 ┃10┃ 2 ┃

┃超二倍体

┃ 8 ┃ 5 ┃

2 ┃

┃亚二倍体① ┃

┃180┃90┃18

┃多倍体②

┃ 30 ┃17┃

4 ┃

┗━━━━━━━━━━━┻━━━━━┻━━━━┻━━━━┛

①亚二倍体如超出上限，可能因制片过程中人为丢掉染色体，应选同批号标

本从头计数。

②一此中期细胞内超出 53 条染色体，即为一个多倍体。

2．无菌检查

每 8～ 12 世代细胞培育物，应进行无菌检查（附录Ⅻ

A）。

3．支原体检查

每 8～ 12 世代细胞培育物，应进行支原体检查 ( 附录Ⅻ B) 。

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细胞库建立标准

4．病毒检查

二倍体细胞株传代过程中，起码对 2 个不一样世代水平进行病毒包含体、乙型肝炎、丙型肝炎、 EB病毒、艾滋病病毒检查等，结果应均为阴性。

5 ．致瘤性检查

每 8～ 12 世代应做一次致瘤性检查 ( 方法见本规程 \" 一、 ( 三 )5 ．致瘤性检查 \") ，结果应无致瘤性。

6．生产过程细胞培育物检查

(1) 染色体检查

可依据制品特征及生产工艺，确立能否进行生产过程中细胞培育物的染色体检查。往常，含有活细胞的制品或纯度不足的制品，应付所用细胞培育物进行染色体

检查及评论 ( 见本规程 \" 三、 1．染色体检查及判断标准 \") 。但如采纳已建株的人二倍体细胞生产，则不要求进行染色体核型检查。

(2) 细胞鉴识试验

按本规程 \" 一、 ( 三) 细胞库细胞的检定 \" 中细胞鉴识试验进行。

(3) 无菌检查

按附录Ⅻ A 进行，应切合规定。

(4) 支原体检测

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按附录Ⅻ B 进行，应为阴性。

(5) 正常细胞外源病毒因子检测

制备病毒类制品时，于接种病毒的当日或在连续传代的最后一次接种病毒时，

留取此批细胞的 2％～ 5％的细胞不接种病毒，换保持液作为正常细胞比较。与接种

病毒的细胞在同样条件下培育，并按本规程

\" 一、 ( 三)4 ．(1) 细胞形态察看及红细

胞吸附试验 \" 和 \"(2) 不一样细胞传代培育法检测病毒因子 \" 的规定进行外源病毒污染检

查。

四、重组细胞的特别要求

重组细胞，系经过 DNA重组技术获取的含有特定基生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程因序列的细胞系，所以重组细胞系的成立应拥有细胞基质建立方法

的有关资料，如细胞交融、转染、挑选、集落分别、克隆、基因扩增及培育条件或

培育液的适应性等方面的资料。细胞库细胞的检查应按本规程

\" 一、

( 三 ) 细胞库细胞的检定 \" 的规定进行，但还应进行下述检查：

1 ．细胞基质的稳固性

生产者须拥有该细胞系用于生产的目的基因的稳固性资料，包含重组细胞系的遗传稳固性、目的基因表达稳固性、目的产品连续生产的稳固性，以及必定条件下保留时细胞生产目的产品能力的稳固性等资料。

2 ．鉴识试验

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细胞库建立标准

除按本规程 \" 一、 ( 三 )1 ．细胞鉴识试验 \" 进行外，还应经过检测目的蛋白基因或蛋白进行鉴识试验。

3 ．重组细胞产物的外源病毒因子检测

应按本规程 \" 一、 ( 三 )4 ． (1) 细胞形态察看及红细胞吸附试验

\" 和 \"(2) 不一样细胞

传代培育法检病毒因子

\" 的规定对细胞裂解物或收获液及生产用培育基进行外源病

毒因子的检测。

五、原代细胞的要求

原代细胞应根源于健康的动物脏器组织或胚胎，包含猴肾、

地鼠肾、沙鼠肾、兔肾、狗肾或动物的胎儿和其余组织，以及鸡胚和鹌鹑胚等正常组织，以适合的消化液消化、分别组织细胞进行培育。原代细胞不可以成立细胞库，只好限于原始培育

的细胞或传代少量几代内使用，没法预先标定。所以，只好严格规范管理和操作举措，以保证以原代细胞为基质所生产的制质量量。

( 一) 动物组织根源和其余资料

1 ．动物组织根源

应切合※※凡例 \" 的有关要求。 对各样动物都应有明确的健康状况和干净级别要求。

2 ．生产或检定用猴

多采纳非洲绿猴、恒河猴等，我国以恒河猴为主。应为笼养或小群混养的正常

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家

细胞库建立标准

健康猴。动物用于制备细胞前，应有

6 周以上的检疫期，检疫期中出现病猴或混入

新猴，应从头检疫。 从外面新引入猴群应做结核菌素试验及猴疱疹 I 型病毒 (B 病毒 ) 的检查。

胎猴 - 肾可用于生产，对其母猴应进行检疫。

( 二) 原代细胞培育物检查

用于细胞制备的动物剖检应正常，取留的器官组织亦应正常，若有异样，不可以 用于制备细胞。

1 ．细胞培育原资料检查及细胞培育操作

按本规程 \" 一、 ( 二)1 ．原资料的选择 \" 及\"2 ·细胞培育操作的要求 \" 进行。

2 ．细胞培育物检查

(1) 细胞形态检查

细胞在接种病毒或用于生产前，其培育物均应进行外观检查和镜检，应无任何 可疑、异样和病变，不然不得用于生产。

(2) 比较细胞检查

每批消化所得原代细胞留取

5％～ 10％ ( 或起码 500m1)悬液，不接种病毒， 细胞

浓度和办理均与生产制品过程同样，起码察看

14 天，并做以下各项检查，结果均应

为阴性。

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细胞库建立标准

①细菌、真菌检查，按附录Ⅻ

A 进行。

②支原体检查，按附录Ⅻ B 进行。

③外源病毒污染检查。对察看到期的细胞，按本规程

\" 一、 ( 三)4 ．(1) 细胞形态

察看及红细胞吸附试验 \" 和 \"(2) 不一样细胞传代培育法检测病毒因子 \" 进行外源病毒污染检测。

④原代细胞培育物特定病毒检查。原代猴。肾细胞培育应检查

SV40病毒、猴艾

滋病毒和 B 病毒，应用 Vero 细胞或原代绿猴肾细胞、兔肾细胞检查。地鼠肾原代细胞应用 BHK21细胞培育检查，察看细胞形态，若有可疑，应在同种细胞上盲传一代连续察看。

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