LC-MSMS在临床中的方法开发和验证

方法开发的过程包括：文献检索、质谱方法建立、液相方法建立和前处理方法建立四大步。

第一、准备方法开发所需检测仪器、辅助设备、相关耗材及试剂等。其中，对于分析方法需要关注以下内容：

（1）样品前处理方法：样品类型、样品量、处理方法的选择，需要考虑样品处理的效果、试剂、耗材及时间成本；（2）质谱方法：离子化方式、质量分析器的选择、仪器型号、扫描方式的选择、离子检测通道及相应质谱参数；

（3）液相色谱方法：色谱柱的选择、流动相的组成、洗脱方式、进样量。 第二、质谱方法建立。质谱方法建立需完成以下步骤：

1.配制纯标准溶液进行质谱扫描，根据目标分析物的极性大小选择合适的离子化方式（ESI、APCI、APPI等），并确定正负离子模式；

2.确定定性定量离子对，在实现分析方法特异性和灵敏度要求的基础上，最好选择两个以上质谱响应高、选择性好、稳定性好的特征碎片离子分别作为定量和定性离子；临床LC-MS/MS方法大多为定量检测，通常采用多反应监测（MRM）或选择性反应监测（SRM）扫描方式；

3.确定合适的离子源参数和扫描参数。

第三，建立液相色谱方法建立。液相色谱方法的建立需要考虑以下内容：

1.色谱柱的选择，包括填料类型（非极性固定相C18、C8、C4、苯基柱等，极性固定相氰基、硅胶、氨基等）、色谱柱可耐受PH值范围（分析物的酸碱性质）；

2.流动相的选择，包括流动相的纯度（超纯水、色谱级溶剂）、流动相的种类（甲醇、乙腈、水等）；

3.流动相添加剂的选择，使用挥发性添加剂（甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵等），尽量不要使用不挥发性添加剂（硫酸盐、磷酸盐等），防止影响离子化效率，损坏仪器；

4.洗脱方式的优化，包括采用等度洗脱还是梯度洗脱、起始溶剂的比例、运行时间、柱温、进样体积等；考虑到临床样本基质的复杂性，尽量选择梯度洗脱模式。

第四，样品前处理方法建立。

生物样本（如血浆、血清、全血、尿液、唾液、胆汁、组织等）基质的高度复杂性使得临床LC/MS/MS方法开发过程中，样品前处理非常重要。样品前处理具有净化样品、提高灵敏度、保护进样系统、延长色谱柱使用寿命、缩短色谱分析过程、提高检测通量等优点。样品前处理方法的建立需要考虑以下内容：

常用的生物样品前处理方法有蛋白沉淀、液液萃取、固相萃取、衍生化、超滤、水解等，需要根据目标分析物的特点和样品类型进行合理选择。

临床LC-MS/MS检验方法开发建立之后，用于实际临床检验之前，必须对建立的新方法进行严格、全面的验证，证明其分析性能满足临床诊断的要求。临床LC-MS/MS方法验证的内容包括方法的精密度（批内、批间）、准确度、回收率、分析测量范围、临床可报告范围、分析灵敏度、基质效应、基质特异性、干扰试验、携带效应、生物样品稳定性、前处理后样品稳定性、方法参考区间的建立与验证等，确保可获得准确、可靠、可重复的结果，为临床诊断提供合格的数据。

方法验证之后，在日常实际临床检验过程中，需要长期观察监测分析方法的稳定性，包括分析参数如定量定性离子对的比值变化、分析物和内标的保留时间、峰形等，同时需要采用完善的质量控制措施，包括室内质控、室间质评等质量保证措施，确保检测结果的准确性和可靠性。