X射线对体外培养乳鼠心肌细胞损伤的初步实验研究

工企医刊２０１０年第２３卷第１期　・论著・　Ｘ射线对体外培养乳鼠心肌细胞损伤的初步实验研究　周　锋　张三典　　（江苏省江阴市中医院检验科，２１４４００）　（江苏苏州大学附属第一医院，２１５０００）摘要　目的：初步探讨一定剂量的Ｘ射线对体外培养乳鼠心肌细胞的损伤。方法：全自动生化分析仪定量测　定不同剂量ｘ射线照射后第２４小时心肌细胞培养基乳酸脱氢酶（１ａｃｔａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＬＤＨ）的含量；激　光扫描共聚焦显微镜观察心肌细胞经４０Ｇｙ　Ｘ射线照射后第２４ｈ的形态学改变。结果：心肌细胞有较高的辐　射抗性，在０Ｇｙ～３ＯＧｙ的放射剂量下心肌细胞培养基乳酸脱氢酶的含量变化不是很明显（Ｐ＞０．０５）；当放　射剂量≥４０Ｇｙ时培养基乳酸脱氢酶的含量显著升高（Ｐ＜０．０５）；激光扫描共聚焦显微镜观察到经４ＯＧｙ　Ｘ　射线照射后第２４ｈ的典型的心肌细胞形态学改变。结论：一定剂量的ｘ射线对心肌细胞有直接损伤作用。　关键词Ｘ射线　乳鼠心肌细胞乳酸脱氢酶　司。　近年来，放射诱发的心脏操作性病变Ｅｌ益增多，　逐渐成为影响放射治疗疗效的重要因素之一。研究　表明：人类心脏受照小部分，心肌细胞可发生凋　１．３．３　ＯＩ　ＹＭＰＵ￥２７００全自动血生化分析仪：日　本ｏＩ　ＹＭＰＵＳ公司。　亡［１］。有学者认为，尽管辐射诱发细胞损伤无论在体　内或体外均不是细胞杀伤的主要模式，但射线诱发　的细胞损伤在体内仍有一定作用乜］。细胞损伤在心　脏的生理、病理发展过程中起着重要作用，被认为是　１．３．４　Ｌｅｉｃａ　ＴＣＳ　ＳＰ　激光扫描共聚焦显微镜系统　ＭＲＣ一１０２４型：Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司。　１．４方法　１．４．１　心肌细胞培养　出生１天～３天的乳鼠（雌　心脏由代偿性变化向病理性变化发展的细胞学基　础。由于心肌细胞的损伤，从而诱发了多种心血管系　统疾病及临床综合症的发生发展。国内外许多文献　报道了放射与心肌细胞损伤的相关性研究，为进一　雄兼用），参照Ｓａｄｏｓｈｉｍａ［３］等介绍的方法。常规以　碘酒、酒精消毒，剪开胸腔，无菌条件取出心脏，放入　无钙镁ＰＢＳ溶液中，剪去心‘房及主动脉，将心室组　织剪成１ｍｍ～３ｍｍ碎片后，用０．２５　胰酶３７℃水　步研究放射对心肌细胞的影响，本文利用体外培养　乳鼠心肌细胞为实验模型，通过不同放射剂量Ｘ射　线照射心肌细胞，利用全自动生化分析仪定量测定　心肌细胞培养上清液中的乳酸脱氢酶的含量变化，　来评价放射诱发心肌细胞损伤程度，并从细胞形态　学的改变进一步评价ｘ射线对心肌细胞的损伤，从　而为探讨Ｘ射线对心脏损伤及其防护提供新的实　验依据。　１材料和方法　浴消化２０ｍｉｎ，收集细胞，打匀后吸出上层，反复５　次～６次。混悬液２０００ｒ／ｍｉｎ，离心ｌＯｍｉｎ。弃上清液　后用ＤＭＥＭ洗涤，混悬液２０００ｒ／ｍｉｎ，离心１０ｍｉｎ，　弃上清液，加ＤＭＥＭ培养液（含２０　小牛血清）制　成细胞悬液，置于培养瓶中培养，待细胞贴壁后，用　差速贴壁法，于５％ＣＯ。，３７℃细胞培养箱中，孵育　９０ｍｉｎ，由于纤维细胞较心肌细胞更易于贴壁，用此　法可使大部分纤维细胞贴壁［４］，取富含心肌细胞的　培养液。转移至另一培养瓶中继续培养。　１．１实验动物供。　选用出生１天～３天的Ｓｐｒａｑｕｅ－－　按此法培养的心肌细胞，于培养后２４ｈ即可见　部分细胞收缩，更换含１５　小牛血清的ＤＭＥＭ培　养液继续培养，每３天换培养液１次，取第４天的细　胞进行实验研究。　Ｄａｗｌｅｙ乳鼠，由苏州大学医学院实验动物中心提　１．２　主要试剂　乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）试剂盒由日本　一化公司提供；吖啶橙（Ａ０）、碘化丙啶（ＰＩ）试剂盒　１．４．２心肌细胞的Ｘ射线照射取对数生长期的　均为Ｓｉｇｍａ公司产品。　１．３仪器　心肌细胞，将贴壁心肌细胞消化制成细胞悬液，用　ＤＭＥＭ培养基将细胞调至３×１０　／ｍｌ，根据实验设　１．３．１　Ｈｅｒａｅｕｓ二氧化碳培养箱ＢＢ１６／ＢＢ５０６０　型：美国ＨＥＲＡＥＵＳ公司。　１．３．２　ＫＤ一２　６ＭＶ直线加速器：德国西门子公　计平均分为６组（每组４瓶），继续培养３天后，分别　置入５ｍｌ离心管，封管并标明组别，至西门子ＫＤ一　２直线加速器下放射，采用６ＭＶ—Ｘ线垂直照射，　・２・　放射野面积１０ｃｍ　ｘ　ｌＯｃｍ大小，射野源皮距１００ｃｍ，　剂量率输出ＤＴ２００ｃＧｙ／ｍｉｎ，分别以１０Ｇｙ、２０Ｇｙ、　３０Ｇｙ、４ＯＧｙ和５０Ｇｙ作用心肌细胞。正常心肌细胞　对照组不照射。　１．４．３　照射后细胞培养上清液中乳酸脱氢酶　（Ｉ　ＤＨ）含量的检测　将上述各实验组带回实验室　继续培养，对照组换无血清培养基，分别在换液后第　２４ｈ收集各组心肌细胞上清液，用全自动生化分析　仪测定心肌细胞培养上清液中乳酸脱氢酶的含量。　１．４．４激光扫描共聚焦显微镜观察放射后心肌细　胞损伤根据上述心肌细胞培养上清液中乳酸脱氢　酶含量的测定结果，选用ＤＴ４０Ｇｙ　Ｘ射线组作为心　肌细胞形态学改变模型，并设正常心肌细胞对照组，　观察第２４小时后心肌细胞损伤的形态学改变。实验　步骤如下：（１）各组细胞分别置人放有盖玻片的２４　孔培养板中，放入３７℃，５％ＣＯ　培养箱培养２４ｈ，待　细胞爬片。（２）吸去培养液，用ＰＢＳ液洗涤２次，加　入ｌｍｌ　ＰＢＳ；（３）分别加入终浓度为５／￣ｇ／ｍｌ吖啶橙　（ＡＯ）和终浓度为１０￣ｇ／ｍｌ碘化丙啶（Ｐ１）孵育爬片　细胞；（４）放入３７　Ｃ温箱３０ｍｉｎ染色；（５）取出爬有　心肌细胞的盖玻片反置于载波片上，至激光扫描共　聚焦显微镜下观察细胞并判断。　１．４．５统计学分析实验数据以均数±标准差（Ｘ　±ＳＤ）表示，采用ＣＳ１０．０统计软件包进行各组间单　因素方差分析，ｔ检验和Ｘ。检验。　２　结果　２．１　经ＤＴ４０Ｇｙ辐射剂量照射心肌细胞后第２４　小时，用（Ａ０／ＰＩ）双染色法在激光扫描共聚焦显微　镜下可观察到典型的心肌细胞损伤的形态学改变　（如核固缩、核碎裂、胞内空泡形成）。　２．２不同放射剂量的Ｘ射线对培养上清液中心肌　细胞ＬＤＨ释放量不同　心肌细胞有较高的辐射抗　性，在单次大剂量放射１０Ｇｙ￣３ＯＧｙ时，乳鼠心肌细　胞培养上清液中ＬＤＨ释放量虽随放射剂量的增大　而增加，但ＬＤＨ释放量变化不明显（Ｐ＞０．０５）；当　放射剂量≥４０Ｇｙ时，心肌细胞培养上清液中ＬＤＨ　释放量显著增加，统计学显示有意义（Ｐ＜０．０５）。见　附表。　３讨论　近年来随着肿瘤放化疗综合治疗的广泛应用和　ｌ临床疗效的提高，某些肿瘤患者的生存期明显延长，　一些胸部肿瘤接受放疗而引发的心脏放射损伤变得　较为常见，且日益引起人们的重视［ｓ］。国内外流行病　学调查和动物实验证明，放射对心脏有直接的损伤　工企医刊２０１０年第２３卷第１期　附表　不同放射剂量下培养上清液中心肌细胞　ＬＤＨ释放量　与正常对照组比较，＊Ｐ＜０．０５　作用。随着分子生物学向放射医学领域的渗透，人们　对辐射引起细胞损伤的认识达到了一个新的高度。　但目前对放射诱发心脏损伤机制还并不十分清楚。　尽管在体内乳酸脱氢酶主要存在于骨骼肌中，其次　才是心脏，然而在离体培养心肌细胞内，ＬＤＨ的活　性却反映了心肌细胞内糖酵解产能和氧化磷酸化产　能系统的功能状态［６］。乳酸脱氢酶（Ｉ　ＤＨ）是心肌细　胞的胞浆酶。在正常情况下，ＬＤＨ存在于细胞内，当　心肌细胞受到损伤后，细胞膜通透性增加，胞内大量　ＬＤＨ漏出至细胞间隙和体液，而心肌细胞损伤后酶　从胞浆中漏出与细胞膜的功能受损有关。故心肌细　胞培养基中乳酸脱氢酶含量，可作为评价心肌细胞　损伤程度的指标之一。　本实验结果显示，心肌细胞有较高的辐射抗性，　在单次大剂量放射１０Ｇｙ￣３０Ｇｙ时，乳鼠心肌细胞　培养上清液中ＬＤＨ释放量虽随放射剂量的增大而　增加（重复２次），但ＬＤＨ释放量变化不明显（Ｐ＞　０．０５）；当放射剂量≥４０Ｇｙ时，心肌细胞培养上清液　中ＬＤＨ释放量显著增加（重复２次），统计学显示　有意义（Ｐ＜０．０５）。这提示我们放射线对心肌细胞　有直接损伤作用。　ＡＯ【７］为一种活性染料，对活细胞及死细胞均能　染色，ＰＩ［８　只对失去膜完整性的细胞染色。在共聚焦　显微镜下，细胞核ＤＮＡ为黄色或黄绿色均匀荧光，　细胞质和核仁的ＲＮＡ为桔黄或桔红色荧光。细胞　受损伤时，细胞核和细胞质内可见致密浓染的黄绿　色，甚或黄绿色碎片。细胞坏死时，细胞质内黄绿色　或桔黄色荧光减弱或消失。细胞损伤早期，细胞膜结　构尚完整，阳离子染料ＰＩ无法进入细胞内。细胞损　伤晚期胞膜结构被破坏，ＰＩ可以进入细胞内使核染　色质着红色。因此，同时使用这两种荧光染料对细胞　染色时，仅有ＡＯ着色的为早期损伤细胞，仅有ＰＩ　着色的为坏死细胞，两种染料双阴性者为正常活细　胞，双阳性者为继发性坏死细胞。故早期损伤细胞呈　工企医刊２０１０年第２３卷第１期　致密浓染的黄绿色，由于染色质凝聚及核裂解，细胞　核中常有桔红色斑点。晚期损伤细胞可被ＡＯ染成　致密浓染的黄绿色，甚至可见黄绿色碎片，其细胞核　１２２４～ｌ２２６．　参考文献　１　Ｃｏｌｕｃｃｉ　ＷＳ．Ａｐｏｐｔｏｓｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｈｅａｒｔ［Ｊ］．Ｎ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ．１　９９６，３３５：　也常呈损伤的特征性变化。　本实验结果发现，经ＤＴ４０Ｇｙ放射剂量照射心　肌细胞后第２４小时，培养乳鼠心肌细胞发生明显的　２　胡野．凌志强．单小云．等．主编．细胞凋亡的分子医学（第一版）　［Ｍ］．北京：军事医学科学出版杜　２００２．４３８～４４８．　３　Ｓａｄｏｓｈｉｍａ　Ｊ，Ｊａｈｎ　Ｌ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｔ．ｅｔ　ａ１．Ｍｏｌｅｅｕｌａｒ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ—　ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔｒｅｔｃｈ—ｉｎｄｕｃｅｄａｄａｐｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｃａｒｄｉａｃ　ｃｅｌｌｓ　细胞损伤的形态学改变（如脱核、核碎裂、胞质空泡　ＥＪ］．Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，１９９２．２６７：１０５５１～１０５６０．　４　Ｐｏｌｌｎｇｅｒ　１Ｓ．Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌ　ｔｙｐｅｓ　ｉｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｈｅａｒｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ　形成等）。　对放射诱导心肌细胞死亡的机制，一般认为，放　ｒＪ］．Ｅｘｐ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．１９７０．６３：７８～８２．　５　Ｇａｇｌｉａｒｄｉ　Ｇ，Ｌａｘ　Ｉ－Ｒｕｔｑｖｉｓｔ　ＬＥ．Ｐａｒｔｉａｌ　ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｅａｒｔ　射线导致的细胞死亡是通过放射线的间接作用生成　［Ｊ］．Ｓｅｍｉｎ　Ｒａｄｉａｔ　Ｏｎｃｏ１．２００１，ｌ１：２２４～２３３．　活性氧等有害基因而形成的。放射通过“直接作用”　６文琛．曹庆淑．马惠敏．等．脱氢酶在心肌细胞的定位及缺血后的　和“间接作用”产生大量自由基而杀伤细胞［９］。辐射　变化，解剖学杂志．１９９４，１７（６）：５１４～５１８，　诱发细胞损伤不但与细胞的辐射敏感性有关［１　，而　７　Ｍｉｃｈｅｌ　Ａ　Ｈ，Ｆｒａｎｋ　Ｔ．Ｚｂｉｇｎｉｅｗ　Ｄ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．．１９９２．２０１．１８４　～且与细胞类型也有很大关系，辐射敏感细胞就比辐　ｌ９１．　８　Ｄｏｕｇｌａｓ　Ｊ　Ｅ　Ｅ．Ａｎｇｅｌａ　Ｈ・Ｄｉａｎｅ　Ｊ　Ｈ，Ｃｈｒｉｓｔｏｓ　Ｐ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．．　射抗性细胞易发生损伤。另外，细胞损伤与生物体的　１９９６．５６．２２７３～２２７６．　生理节律也有关，即细胞周期各时相对射线引发的　９　Ｍａｃｌｅｌｌａｎ　ＷＲ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ　ＭＤ，Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　ｃｅｌｌ　ｄｅａｔｈ　ｉｎ　ｃａｒｄｉｏ—　细胞损伤敏感性也不同。　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｃｉｒ　Ｒｅｓ，ｌ９９７，８１（１）：１３７～１４４．　由于实验条件及时闻所限，未能分别从放射后　１０　Ｒｕｉｚｄｅ　Ａ　Ｉｎｏｄｏｖａｒ　ＪＭ．Ｎｕｎｅｚ　Ｍ　１．Ｍｃ　Ｍｉｌｌａｎ　ｒｒ　ｊ．ｅｔ　ａ１．Ｉｎｉｔｉａｌ　不同时间点跟踪检测心肌细胞培养基中乳酸脱氢酶　ｒａｄｉａｔｉｏｎ—ｉｎｄｕｃｅｄ　ＤＮＡ　ｄａｍａｇｅ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｔｕｉｎｏｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ：ａ　含量，从而更好地评价放射与心肌细胞损伤的关系，　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ［ｊ］．Ｂｒ　Ｊ　Ｃａｎ—　ｃｅｒ．１９９４，６９（３）：４５７～４６２．　这还有待进一步研究。　（２００９—１Ｏ一３Ｏ收稿）　７２８例送检痰标本的分离培养及药敏结果分析　苏秀玲王敬衍　（山东济宁医学院附属金乡医院，２７２２００）　摘要　目的：了解我院２００８年痰培养的致病菌分布及药敏情况，指导临床合理使用抗生素。方法：对送检痰　标本进行常规培养后，提取可疑茵落用法国生物梅里埃全自动细菌鉴定仪Ｖｉｔｅｋ系统及配套鉴定卡和药敏　卡鉴定菌株及进行药敏试验。结果：在７２８例痰标本中共培养出致病菌５９０株，此外，ＥＳＢＩ　Ｓ菌株耐药性明　显高于非ＥＳＢＩ　ｓ。结论：痰培养致病茵分布结果提示，随着抗生素的滥用和免疫力低下人群的增加，以往致　病性较弱的条件致病菌成为了呼吸道感染的主要致病菌，而药敏结果则显示呼吸道感染致病茵对常用抗生　素的耐药普遍比较严重，这就要求临床医生要重视痰培养，谨慎用药，避免致病菌耐药性的进一步扩大。　关键词　痰培养　呼吸道感染　致病茵分布　耐药性　条件致病菌　呼吸道感染疾病作为临床常见病、多发病，与抗　１　材料与方法　生素的使用密切相关。随着激素、免疫抑制剂、广谱　１．１标本来源　收集我院２００８年１月￣２００９年１　抗生素及介人性治疗的广泛应用，细菌感染率和耐　月送检的痰标本共７２８例。　药率呈逐年上升趋势。因此做好细菌耐药性监测，合　１．１．１　取材晨起生理盐水漱口后咯痰至无菌容　理使用抗生素，控制细菌耐药发生发展势在必行。为　器中，立即送检，先行涂片，镜检白细胞与上皮细胞　帮助临床医师及时诊断合理治疗，掌握细菌感染的　的比大于２．５为合格痰，不合格者重新留取。　种类及耐药性情况，控制细菌耐药性的进一步提高，　１．１．２培养基　自制血平板、巧克力平板及沙保弱　现就我院２００８年１月￣２００９年１月的送检痰标本　氏培养基。　７２８例分离培养和药敏试验结果进行致病菌分布和　１．１．３　仪器　法国生物梅里埃全自动细菌鉴定仪　耐药性分析。　Ｖｉｔｅｋ系统及配套鉴定卡和药敏卡。