大叶胡颓子根的化学成分预试及抗菌作用研究

江苏农业科学２０１０年第３期　－——３５３－－——　刘建萍，由宝昌，张晓晖，等．大叶胡颓子根的化学成分预试及抗菌作用研究［Ｊ］．江苏农业科学，２０１０（３）：３５３—３５５　大叶胡颓子根的化学成分预试及抗菌作用研究　刘建萍，由宝昌，张晓晖，王国辉，于　岩，王　宁，张雨辰　（中国农业大学烟台研究院，山东烟台２６４６７０）　摘要：采用系统预试方法初步测定了大叶胡颓子根化学成分的类型，以纸片法和平板法观察其醇提物对４种常　见呼吸道感染菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克氏杆菌）和革兰氏阳性代表菌（枯草芽孢杆菌）的　抑制作用。结果表明：大叶胡颓子根中含有糖及苷类、甾体或三萜类、强心苷、皂苷和酚类、鞣质、有机酸、蛋白质、氨基　酸等；大叶胡颓子根醇提物对５种供试菌有较强的体外抑制作用，最低抑菌浓度（ＭＩＣ）较低。大叶胡颓子根含有多种　活性物质并具有较强的体外抗菌作用，有望成为治疗呼吸道感染的新药材。　关键词：大叶胡颓子；根；成分预试；体外抗菌作用　中图分类号：Ｒ２８５．６　文献标志码：Ａ　文章编号：１００２—１３０２（２０１０）０３—０３５３—０３　大叶胡颓子（Ｅｌａｅａｇｎｕｓ　ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ　Ｔｈｕｎｂ），别名冬枣、　１．２．２乙醇提取液大叶胡颓子根粗粉１０　ｇ，加入１００　ｍＬ　圆叶胡颓子，青岛俗称海枣，为胡颓子科胡颓子属常绿盐生灌　石油醚（沸程６０—９０　）浸泡３　ｈ，抽滤。滤渣挥发干溶剂，　木，主要产于我国山东青岛、威海滨海及岛屿，江苏、浙江的沿　加９５％乙醇１００　ｍＬ，在水浴上加热回流１　ｈ，过滤。滤液留　海岛屿以及台湾，日本、朝鲜也有分布。其根、叶、果皆可入　２　ｍＬ进行酚类、鞣质、有机酸的预试验，其余浓缩成浸膏。浸　药，有收敛、止泻、平喘、止咳、治吐血不止之效…，民间以果　膏分为２部分，一部分置于研钵中，用２％ＨＣ１溶解，过滤。取　实代丹皮用于治妇科病。因大叶胡颓子耐干早、瘠薄，耐盐　盐酸水溶液进行生物碱试验，附在滤纸上的残渣再以少量乙　碱，抗海风、海雾，是适合滨海盐碱土种植的药用植物，具有广　醇溶解，做黄酮、蒽醌试验。另一部分浸膏再以少量醋酸乙酯　阔的开发前景。关于大叶胡颓子的化学成分和药理作用尚未　溶解，溶液置分液漏斗中加适量５％ＮａＯＨ振摇，使酚类物质　见相关报道。本试验对大叶胡颓子根的化学成分进行了初步　及有机酸等转入下层氢氧化钠水溶液中，醋酸乙酯部分用蒸　鉴定，并对其醇提物进行了体外抗菌作用研究，为进一步进行　馏水洗至中性，将醋酸乙酯液２—３　ｍＩ　在水浴上蒸干，以１—　生物活性成分的提取、分离、纯化提供研究基础，并为大叶胡　２　ｍＬ乙醇溶解作香豆素与萜类内酯和强心苷的检测。　颓子的开发利用提供科学依据。　１．２．３水提取液大叶胡颓子根粗粉５　ｇ，加入５０　ｍＬ石油　１材料与方法　醚（沸程６０—９Ｏ℃）浸泡３　ｈ，抽滤。滤渣挥干溶剂，加９５％　乙醇５０　ｍＬ，在水浴上加热回流ｌ　ｈ，抽滤。滤渣挥发干溶剂　１．１试验材料、试剂及仪器　－　后，加水５０　ｍＬ，在５０～６０℃的水浴上加热１　ｈ后过滤。此滤　（１）材料：大叶胡颓子，２００９年５月１８日采于青岛，根风　液在试管及滤纸片上做多糖及苷类、有机酸、皂苷、酚类、鞣　干后粉碎，过０．２５　ｍｍ筛。（２）供试菌种：金黄色葡萄球菌　质、氨基酸、蛋白质、生物碱预试验。　（ＳｔｏｐｈｙｌＯＣＯＣＣｎＳ　ａｕｒｅｕｓ）、大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、铜绿假单　１．３体外抑菌试验　胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、肺炎克氏杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　１．３．１　提取物制备大叶胡颓子根粗粉１０　ｇ，加１００　ｍＬ　９５％　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）和枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ），均由中国农业　乙醇浸泡２４　ｈ，回流提取９０　ｒａｉｎ，抽滤得滤液。药渣加入３倍　大学生物学院微生物实验室提供。（３）试剂：９５％乙醇、石油　的７０％乙醇提取６０　ｒａｉｎ，滤得药液。合并２次滤液后置于旋转　醚、氯仿等均为分析纯；牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉，均为生化用　蒸发仪中减压浓缩，浓缩后的浸膏置干燥箱中烘干（４０℃）。　品；纯化水：实验室自制；其他试剂：自配。（４）仪器：电子控　１．３．２菌种活化及菌悬液的制备分别将各供试菌种移接　温电热套；旋转浓缩仪（上海亚荣生化仪器厂）；ＡＢ２０４　Ｂ型　入营养琼脂斜面培养基上，于３７℃培养箱中培养２４　ｈ。将活　电子分析天平（瑞士梅特勒公司）；Ｄ型水浴锅（山东龙口市　化好的菌种分别取１环，制成初始菌悬液，取适量初始菌悬液　先科仪器公司）；恒温培养箱（山东潍坊医疗器械厂）。　用生理盐水稀释成含菌量为１．０×１０　～１．０×１０。ＣＦＵ／ｍＬ的　１．２化学成分预试验　菌悬液备用。　１．２．１石油醚提取液大叶胡颓子根粗粉ｌ　ｇ，加１０　ｍＬ石　１．３．３抑菌试验——纸片法　取０．１　ｍＬ菌悬液涂布于平　油醚（沸程６０～９Ｏ　），密闭浸渍３　ｈ，过滤，滤液置表面皿上　板培养基（约１５　ｍＥ），将灭菌后直径９　ｍｍ的滤纸圆片在药　任其挥发，残留物进行甾体或三萜类、挥发油和油脂的试验。　液中浸泡２０　ｍｉｎ后取出，贴于平板上，每种菌各设４个重复，　以无菌水为对照（以上操作均在无菌条件下进行）。于３７℃　收稿日期：２０１０—０２—０３　培养箱中培养２４　ｈ后测定抑菌圈直径，取平均值，所得数据　基金项目：中国农业大学烟台研究院科研基金（２００９）。　进行方差分析。　作者简介：刘建萍（１９６２一），女，博士，副教授，主要从事植物组培及　１．３．４最低抑菌浓度（ＭＩＣ）测定——平板涂布法　用无　天然产物化学的研究。Ｔｅｌ：（０５３５）６９２３７１６；Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｕｊｐ８１６＠　菌水稀释根提取物，使其生药浓度分别为０．１６６　７、０．０８３　３、　１２６．ｃｏｎ。　０．０４１　７、０．０２０　８、０．０１０　４　ｇ／ｍＬ。取不同浓度提取物１０　ｍＬ　．－——３５４．－——　江苏农业科学２０１０年第３期　有酚类、鞣质、有机酸、甾体和强心苷，无法确定是否存在黄　酮，未检测到生物碱、蒽醌、香豆素与萜类内酯。水提取液中　含有糖及苷类、有机酸、蛋白质、氨基酸、皂苷和酚类、鞣质，未　检测到生物碱。　２．２　大叶胡颓子根提取物的抑茵效果　加入高温灭菌后冷却至５０℃左右的２５０　ｍＬ培养基中，混匀　后倾注平皿，培养基冷却后用接种环涂布供试菌种，设不含药　物的平皿为对照。在３７℃培养箱中培养２４　ｈ后观察菌体生　长情况，无菌生长的培养基中提取物浓度最低者即为ＭＩＣ。　２结果与分析　２．１　大叶胡颓子茎化学成分预试结果　大叶胡颓子根提取物对５种供试菌的抑菌试验结果见表　２、表３。大叶胡颓子根对５种供试菌皆有抑制作用，抑菌圈　比较结果显示：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌、　铜绿假单胞菌、肺炎克氏杆菌之间有极显著差异，大肠杆菌与　大叶胡颓子茎的石油醚提取液、乙醇提取液和水提取液　的化学成分预试结果（表１）表明，石油醚提取液中含有甾体　或三萜类，未检测到油脂和挥发油。在９５％乙醇提取液中含　金黄色葡萄球菌之问没有显著差异，枯草芽孢杆菌、铜绿假单　表１　大叶胡颓子根化学成分预试结果　注：标有“△”的反应表示在滤纸上进行，其余的反应皆在试管中进行。“＋”表示结果为阳性，“～”表示结果为阴性，“±”表示结果不确定。　刘建萍等：大叶胡颓子根的化学成分预试及抗菌作用研究　表２大叶胡颓子根提取物对不同细菌抑菌圈的比较　葡萄球菌的ＭＩＣ为生药３．３３２　ｍｅ，／ｍＬ，对枯草芽孢杆菌、铜绿　假单胞菌的ＭＩＣ为生药６．６６７　ｍｇ／ｍＬ，对肺炎克氏杆菌的　ＭＩＣ大于生药６．６６７　ｍｇ／ｍＬ。体外抑菌试验结果说明大叶胡　颓子根中存在有效抗菌成分。　３结论　大叶胡颓子根中含有甾体或三萜类、糖及苷类、皂苷、酚　类、鞣质、有机酸、蛋白质、氨基酸和强心苷。这些活性物质具　表３　大叶胡颓子根提取物对不同细菌抑制效果的方差分析　有多种药理功能，说明大叶胡颓子根具有多种生物活性，其药　理作用有待于进一步研究。　大叶胡颓子根醇提物对革兰氏阴性菌——铜绿假单胞　菌、大肠杆菌、肺炎克氏杆菌和革兰氏阳性菌——金黄色葡萄　球菌、枯草芽孢杆菌皆有明显的抑菌效果，其中，对大肠杆菌　胞菌、肺炎克氏杆菌之间无显著差异。说明大叶胡颓子根对　和金黄色葡萄球菌的抑制效果最大，对５种供试菌的ＭＩＣ均　较低。铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克氏杆菌和大肠　杆菌均为常见的呼吸道致病菌，说明大叶胡颓子根对常见的　呼吸道致病菌有较强的体外抗菌作用，有望成为治疗呼吸道　感染的中药材，以此研制开发抗菌消炎新药物。　体外抑菌试验结果和化学成分预试结果均说明：大叶胡　颓子是值得研究、开发、利用的药用植物。　参考文献：　［１］袁雪丽，辛兆学，辛卫忠，等．野生观赏木本植物大叶胡颓子驯化　及开发利用研究［Ｊ］．山东林业科技，２００７（５）：４９—５０．　［２］张均田．现代药理实验方法［Ｍ］．北京：北京医科大学协和医科　大学联合出版社，１９９８：１４０９—１４１５．　［３］赵淑艳，呼世斌，吴焕利，等．山茱萸提取物抑菌活性成分稳定性　大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用显著大于对枯草芽孢　杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克氏杆菌。　２．３　大叶胡颓子根提取物的ＭＩＣ　由表４可知，大叶胡颓子根提取物对大肠杆菌和金黄色　表４大叶胡颓子根提取物对供试菌的最小抑菌浓度　注：ＣＫ为无菌水对照组；“一”表示无菌生长；“＋”表示菌生长　较弱；“＋＋”表示菌生长较强；“＋＋＋”表示菌生长强。　的研究［Ｊ］．食品科学，２００８，２９（１）：９８—１０１．　（上接第３５２页）　率、存储性能与可重复性较差，这可能是由于部分酶的流失所　导致的。因此交联包埋法更有利于酶与载体的交联，在优化固　定化条件进行工业生产时可以对此方法进行更深入的研究。　参考文献：　一　、√　妲　谧　霞　［１］郭松林．纤维素酶及其在畜禽生产中的应用研究进展［Ｊ］．广东　饲料，２００１（４）：２６—２８．　［２］Ｔｅｅｆｉ　Ｔ　Ｔ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ：ｎｅｗ　ｉｎｓｉｇｈｔ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｆｕｎｃ—　回收次数　图６　重复使用次数对固定化酶活力的影响　ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，１５　（５）：１６０—１６７．　［３］Ｗｏｏｄ　Ｔ　Ｍ，ＭｃＣｒａｅ　Ｓ　Ｉ．Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓｏｌａｎｉ：Ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ　酶活性比较稳定，２５　ｄ后，直接包埋法固定化酶的剩余酶活　仅为１９％，包埋交联法固定化酶的剩余酶活为３９％，交联包　埋法固定化酶的剩余酶活为４８％，说明交联包埋法固定化香　菇纤维素酶的贮藏稳定性较好。　３结论　ａｎｄ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃ１　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ［Ｊ］．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　１９９７，５７：１１７—１３３．　［４］Ｓａｎｄｅｒｓ　Ｄ　Ａ，Ｂｅｌｙｅａ　Ｒ　Ｌ，Ｔａｙｌｏｒ　Ｔ　Ａ．Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｐｅｎｔ　ｃａｓｉｎｇｓ　ｗｉｔｈ　ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ　ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ［Ｊ］。Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０００，７１　（２）：１２５—１３１．　［５］Ｂｕｓｔｏ　Ｍ　Ｄ，Ｏｒｔｅｇａ　Ｎ，Ｐｅｒｅｚ—Ｍａｔｅｏｓ　Ｍ．Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｐ—ｄ—　ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｉｎ　ａｌｇｉｎａｔｅ　ｇｅｌ　ｂｅａｄｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ—　ｔｒｙ，１９９５，３０（５）：４２１—４２６．　本试验以海藻酸钠为包埋材料，对３种不同固定化香菇　纤维素酶的方式进行比较研究。结果表明，３种固定化酶都　具有良好的耐热性和ｐＨ值稳定性，其中交联包埋法固定化　酶在固定率、与底物的亲和程度、操作稳定性、存储稳定性上　均优于其他２种固定化方法。而直接包埋法固定化酶的固定　［６］肖志方，伍林，易德莲，等．海藻酸钙凝胶固定葡萄糖氧化酶的　研究［Ｊ］．化学与生物工程，２００８，２５（２）：４２—４４．　［７］虞云龙，盛国英．一种固定化酶对氰戊菊酯的降解特性［Ｊ］．农　药学学报，１９９９，１（１）：７４—７７．　．