生理学(2015级)细胞膜离子通透性的测定

细胞膜离子通透性的测定——电压钳实验

早在 1902 年，Julius Bernstein就提出膜学说用以解释生物电的产生机制，认为细胞膜两侧带电离子的不同分布和跨膜扩散是产生生物电的基础。但直到 1939 年英国科学家Alan Hodgkin和Andrew Huxley在枪乌鲗巨神经轴突横断面上插入 0.1mm直径的微电极才第一次真正记录到了静息电位。由于他们测得的细胞内电位数值和K+的平衡电位非常接近，从而证实了Bernstein膜学说中关于静息电位产生机制的推断，即在安静情况下细胞膜对K+通透性较大，K+外流是静息电位产生的主要原因。然而，Hodgkin和Huxley在接下来记录细胞受到刺激发生动作电位的实验中发现，动作电位的幅度大大超过了零电位，表现为膜电位的倒转。这一现象无法用Bernstein膜学说中提出的动作电位是膜对各种离子通透性普遍增大而使静息电位暂时消失来解释，因为这样的解释，其结果是膜电位变为零。Hodgkin和Huxley发现，用葡萄糖或氯化胆碱等张地替代细胞外液中Na+时，动作电位幅度会随着细胞外液中Na+的减少而降低；又考虑到动作电位的超射值（+30～+50mV）接近经公式计算的钠平衡电位

（+50～+70mV）。Hodgkin和Huxley由此认为：动作电位发生时膜对Na+的通透性瞬间增大，并远超过对K+的通透性，动作电位的去极化和复极化时相可能是膜对Na+和K+的通透性发生选择性改变的结果。然而，如何能够直接观察动作电位期间膜对Na+和K+通透性的变化呢？ 20 世纪 40 年代后期，Hodgkin和Huxley设计并成功地在枪乌鲗巨轴突上进行了著名的电压钳（voltage clamp）实验。他们通过测定跨膜离子电流来观察膜通透性的改变，证实了膜对 Na+和K+通透性的相继改变是形成动作电位的离子基础。由于这一贡献，Hodgkin和Huxley 共同获得了 1963 年的诺贝尔生理学和医学奖。

Hodgkin和Huxley通过测定膜电流来反映膜对离子通透性的改变，其设计依据是欧

姆定律。因为从电学角度看，离子跨膜移动可形成离子电流（Iion），膜的通透性即是离子通过膜的难易程度，可用膜电阻（R）或其倒数膜电导（Gion）表示，推动离子跨膜移动的动力则是由电位差和浓度差决定的该离子的电-化学驱动力，可用膜电位和离子平衡电位的差值（Vm − Eion）来表示。根据欧姆定律，Iion = Gion .（Vm − Eion），如果将驱动力Vm − Eion加以固定，离子电流Iion的变化即可用来表示膜电导Gion或膜通透性的变化。然而，在动作电位期间，尽管Eion因离子移动量少不会发生显著变化，但膜电位Vm则可发生快速显著的变化，如从−65mV改变为+30mV，这就使离子跨膜移动的驱动力Vm − Eion发生了显著变化，从而使测量所得的离子电流Iion的变化便失去了意义。

在测定膜电流时如何能使膜电位Vm保持不变？Hodgkin和Huxley在电压钳实验中，巧妙地应用了Kenneth Cole在 1940 年发明的电压钳技术，实现了膜电位的固定。“钳”（clamp）即是固定的意思。电压钳实验的基本原理如图 1 所示，在被钳制的枪乌鲗轴突横断面上插入两根微电极（此为双电极电压钳，以后的电压钳技术通过快速的开关转换只需一根电极也能完成双电极的功能），一根是记录膜电位的电极E'，通过放大器（X1）输入到示波器监测膜电位Vm。同时，将信号（Vm）输入到反馈放大器（FBA），与另一个指令电位（钳制电位） VC进行比较。当两者电位相等时（如钳制电位等于静息电位），反馈放大器的输出电流为零；当两者出现差异时（如钳制电位突然由静息电位改变为 0mV，相当于一个刺激），FBA将输出一个电流，经电极I'向细胞内注入。该电流流过细胞膜产生的电位差使新的膜电位趋向于钳制电位VC，当新的膜电位达到钳制电位水平时，反馈放大器的输入端因无电位差而注射电流便停止。如此，便构成一个使膜电位Vm始终跟随或等于钳制电位VC的反馈电路。该装置之所以称为“电压钳”，正是因为它能将膜电位“控制”或“钳制”到任何想要的水平。这种由改变钳制电位产生的注射电流通过细胞膜的阻容耦合电路时可首先记录到的一个由膜被动特性决定的电容充电电流或称刺激伪迹。重要的是，当细胞固定于某一钳制电位VC 时，如果膜电导Gion在此时发生改变，就会出现随Gion而变化、能够反映Gion改变的跨膜离子电流Iion。同样地，电压钳反馈电路也会极其灵

敏地探测到由于跨膜离子电流Iion出现而改变的膜电位，并发生快速反应，经电极I'注入与跨膜离子电流Iion同样大小但方向相反的电流（上述充电电流或刺激伪迹之后记录到的电流），以精确地对抗跨膜离子电流而使膜电位保持恒定。所以，电压钳记录到电流实际上并不是跨膜离子电流Iion本身，而是跨膜离子电流的镜像电流。总之，电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流，抵消离子通道开放时所产生的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值的。如此，便可通过改变膜电位的钳制水平，记录不同膜电位下出现的跨膜电流，从而观察膜电导Gion的变化规律。

图 1 电压钳工作原理模式图

Hodgkin和Huxley设计电压钳实验的第一个目标是，确定神经元膜对离子的通透性是否具有电压依赖性。结果表明，当膜电位设定为超极化状态时，不能引起跨膜离子电流和膜电导的变化；只有设定为去极化水平时，才有可能记录到跨膜离子电流。例如，当膜电位由 −65mV突然固定到−9mV并持续几毫秒时，首先出现一个向下的内向电流，随后又出现一个向上的外向电流。这说明，去极化期间有膜电导Gion的变化。进一步的问题是，去极化引起的内向和外向电流是什么离子携带的？也就是说，去极化使膜对哪些离子的通透性发生了改变？实验表明，早期出现的内向电流的大小受去极化程度的影响，其翻转电位接近Na+的平衡电位。而且，去除细胞外的Na+可引起早期内向电流极性倒转，但不影响外向电流。特别是，给予特异性影响膜Na+通透性的药物河豚毒（tetrodotoxin, TTX）时，可阻断内向电流；给予特异性影响膜K+通透性的药物四乙铵（tetraethylammonium,

TEA）时，可特异性阻断外向电流。这些结果证明，持续去极化过程中有两种离子的膜电导发生了改变。Na+电导（GNa）首先加大，然后迅速减小；K+电导（GK）增加较慢，却可持续保持。这就形成了首先出现向下的内向电流，随后出现向上的外向电流。

Hodgkin和Huxley电压钳实验的结果进一步证实，膜电导具有电压依赖性和时间依赖性。由于电压钳技术可方便地提供在任何膜电位水平下膜通透性的信息，因此可将膜电位钳制于不同的水平，记录到一组膜电流。再根据欧姆定律，可换算成一组膜电导值，用以研究膜电导和膜电位的关系。实验结果如图 2A所示，GNa和GK都随着去极化幅度的增大而增大。其中，去极化程度的增加可引起GNa增加，而GNa增加引起的Na+内流又促进了膜电位的去极化，两者互为增强，表现为GNa的正反馈性激活（图 2B），这一特征有助于动作电位去极化时相的快速形成；去极化也使GK增大，但GK增大后引起的K+外流将使膜电位向去极化的相反方向变化，即转入复极化，这可促使去极化后的膜电位向静息电位迅速恢复（图 2C）。同时， GNa和GK还具有明显的时间依赖性。GNa表现为快速（小于 1ms）一过性激活（电导最大值前为激活，之后为失活），这使Na+内流首先出现，引发了动作电位去极化的产生；GK则在 GNa失活时逐渐激活，这使K+外流出现在Na+内流之后，与GNa失活共同导致了膜的复极化。

图 2 膜电导的电压依赖性和时间依赖性 电压钳实验观察到的GNa和GK的变化，很好地解释了动作电位的成因：当细胞受到有效刺激时，细胞膜的GNa将首先增大，Na+在较大的电化学驱动力推动下出现Na+内流，Na+内流引起的去极化达到一定程度后，去极化与GNa之间出现正反馈，使膜电位急剧上升，形成动作电位迅速上升的去极化时相和超射。动作电位到达峰值后GNa迅速下降，同时GK逐渐增大，细胞内的K+在强大的外向驱动力作用下快速外流，使膜迅速复极化，形成动作电位的

降支，并与升支共同构成尖峰状的锋电位。

（祁金顺供稿）

单通道电流的记录——膜片钳技术

Hodgkin和Huxley用电压钳技术记录到了去极化时膜电导的改变，证明了动作电位的发生与膜对Na+和K+通透性的改变有关。但膜通透性改变的本质是什么？Hodgkin和Huxley在电压钳记录全细胞电流的时代就提出了离子通道的概念，指出离子通道是膜上一些具有离子选择性的孔道（hole）。根据电压钳实验中测得的离子电导和离子电流特征，他们推测离子通道应该具备以下特征：（1）允许离子高速率地通过（可高达每秒 100 万个）；（2）借助电化学驱动力推动离子流动；（3）具有一定的离子选择性；（4）电压门控离子通道能感受电压的改变。甚至，根据Na+电导和K+电导的电压依赖性和时间依赖性，Hodgkin和Huxley还提出了电压门控钠通道具有两个闸门（激活门和失活门）、三种状态（静息、激活和失活），电压门控钾通道具有一个闸门（激活门）、两种状态（静息和激活）的工作模型（H-H模型）。然而，关于这些离子通道的描述在当时（20 世纪 50 年代）仍然是推测性的，那时还没有记录到单个离子通道活动形成的离子电流。要想解释膜电导或膜离子通透性改变的本质，还必须通过单通道离子电流的检测以证实离子通道的存在和阐

明它们活动的特征。而实现这一目标首先要解决的，就是背景噪声问题，因为一般的细胞内微电极记录法背景噪声很大，峰值可达 200pA，而单通道电流仅有 1～2pA。1976 年，年轻的德国科学家Erwin Neher和Bert Sakmann在电压钳工作原理基础上创建了膜片钳（patch clamp）技术，成功记录到了骨骼肌终板膜处由单一ACh门控通道开放形成的单通道电流。15 年后，Neher和Sakmann共同荣获了 1991 年的诺贝尔生理学和医学奖。他们于 1981 年发表在《欧洲生理学杂志》上的一篇著名论文《Improved Patch-Clamp Techniques for High-Resolutin Current Recording from Cells and

Cell-free Membrane Patches》至今已被引用近两万次！

膜片钳钳制电压的基本原理与电压钳相同，不同之处在于它使用的微吸管电极并不刺入细胞，而是将它的尖端紧紧吸附于膜上（细胞贴附式，图 1），因而钳制和记录的仅仅是微吸管电极尖端所限定的一小片膜（如几个平方微米），故称“膜片钳”。这一小片膜上可能存在有一个或几个离子通道，因而有可能记录到单个离子通道电流。微电极由玻璃吸管拉制而成，内充盐溶液可以导电，尖端经热抛光后轻压在细胞膜的表面。如果电极尖端的边缘与肌膜封接良好，就能实现小片膜在电学上与周围完全隔离的效果，如果封接不良，电极尖端边缘与膜之间就会产生漏电流，使噪声增大，从而淹没很小的单通道电流（pA级水平）。因此，电极与膜的封接是膜片钳技术成败的一个关键因素。1976 年，Neher和Sakmann用这种方法完成了电阻为 50MΩ的封接，并首次在细胞膜上记录到单通道电流（图 1A）。但当时实验记录的背景噪声仍然较大，电流的分析仍有一定困难。正当人们用各种方法加以改进未能奏效而几乎放弃努力时，Neher于 1980 年在一次实验中偶然向吸管电极的尾端施加了一点负压（20～30cmH2O），封接电阻骤然增大了两个数量级，达到 10～100GΩ，在电学上将膜片与周围近乎完全隔离开来。从而背景噪声显著减低，大大提高了单通道电流记录的信噪比（图 1B）。后来将这种电阻大于 1GΩ（109Ω）的封接称为giga-seal。

图 1 单通道离子电流的记录

A．微电极置于细胞面表形成 MΩ 的封接，记录电流噪声较大；

B．电极内施加轻微负压，封接电阻增加到高达 10 亿欧姆 10～100GΩ，背景噪声

显著减低

应用膜片钳记录单通道离子电流的结果发现：化学和电压门控通道的活动大体呈现关闭和开放两个状态，状态之间转换的速度非常快（<10μs），电流表现为方波；通道开放时具有恒定的电导，电流幅度在pA（10−12安培）级（正态分布）；开放时间和关闭时间是随机的，可以是几毫秒，几十毫秒，甚至上百毫秒（指数分布）；特定的化学信号或特定的电位差可使相应的配体或电压门控通道开放概率增加；全细胞电流是每一瞬间同时出现的各通道的单通道电流叠加而成的。

由于膜片钳技术中微电极不需要直接刺入细胞内，因此可广泛用于各种细胞，特别是哺乳类动物较小的神经细胞，甚至可将微电极置于细胞突起的某一部分。1981 年，Hamill 等在实现 giga-seal 的基础上建立了膜片钳记录的四种模式，即：细胞贴附（cell-attached）式、全细胞（whole-cell）式、内面向外（inside-out）式和外面向外（outside-out）式等（图 2）。其中，细胞贴附式是在最接近生理状态下记录单通道活动的理想模式；全细胞记录模式已将电极内部和细胞内部连通成一体，除可记录全细胞电流外，还能于记录结束后注入染料等物质观察细胞的形态结构（可见，膜片钳已经不仅仅局

限于“膜片”的概念）；内面向外式是指细胞膜膜片的内侧面直接与浴液接触，这有助于观察细胞内各种成分如第二信使、蛋白激酶等对单个离子通道活动的影响；外面向外式是指细胞膜膜片的外侧面朝向浴液，这更方便观察细胞外各种化学因素，如递质、激素、药物等对单通道活动的调制作用。后两种模式在电极尖端都只剩下一个微小而孤立的膜片，完全脱离了细胞体，被称为游离膜片（excised patch），这时膜片两侧（相当于细胞内外）的环境均可人为进行控制。在此基础上，以后又发展了许多新的记录模式，如穿孔膜片钳记录方式、巨膜片记录方式、松散封接记录方式、膜电容测定技术等，从而大大扩展了它的应用领域。其中，穿孔膜片钳（perforatedpatch clamp）技术是一种全细胞记录模式的改良型，预先加入到电极液中的一些穿孔剂如制霉菌素，可在膜片上形成许多小孔，达到全细胞电流记录的效果，同时又可防止细胞内某些关键分子流出细胞进入电极液中。

图 2 膜片钳的四种记录模式

膜片钳技术自创立以来，不仅在记录方式上有很大变化，以膜片钳为基础的应用技术也不断涌现，使用的生物标本日渐繁多，研究对象也已经不局限于离子通道。例如，膜片钳技术还可用于离子泵、交换体以及可兴奋细胞的胞吞、胞吐机制的研究。目前，膜片钳技术与其他生物学技术的结合应用已经成为该技术的主要发展趋势。