代谢组学在中医基础理论研究中的应用

中图分类号：r2-03 文献标识码：a 文章编号：1005-5304（2013）09-0101-04

代谢组学作为一种系统性和整体性的研究方法，可以从整体上反映生物体的功能水平，能较全面地揭示疾病在发展过程中生物体系内所发生的一系列生物化学变化，将这些变化与传统手段的测定结果相联系，能够发现相关疾病发生的早期代谢组标志物簇并评价治疗成果。其研究方法与中医药治疗疾病的整体观念相一致，已广泛应用于中医药的研究。笔者现将近年来代谢组学在中医基础理论方面的研究成果作一综述，为代谢组学在中医学领域的深入应用提供借鉴。

1 关于代谢组学

代谢组学作为一门研究整体生物学功能状况的新兴学科，1999年被nicholson[1]定义为：生物体受外源性物质刺激或基因变异所导致的内源性物质的种类、浓度或相对比例发生改变，这种改变最终体现在血浆、尿液等生物体液中小分子代谢物（分子量在1000 kda以下）的改变上，利用化学计量学的方法可以挖掘代谢物所隐含的信息，揭示外源性物质所诱导的生物学事件发生的靶器官、位点和强弱程度。代谢组学是系统生物学的重要组成部分，主要研究生物或细胞所有低相对分子质量的代谢产物，研究样本大多为尿液、血浆、血清、唾液及动植物的细胞和组织提取液，研究过程主要包括样品制备、代谢产物的检测、分析与鉴定、数据分析与模型建立4个部分。通常，得到样品后，通过简单处理，采用磁共振、色谱质谱联机、毛细管电泳质谱联机等方式获得样本代谢物谱，再应用绘图技术、计算机技术和统计学方法，来获得样本所有代谢物的指纹图谱，从而了解一个生物体代谢随时间变化的规律，找出与之相关联的生物标志物，直接认识生物体的生理和生化状态，从代谢整体的变化轨迹上把握人体健康状态和疾病的转归。

与当前流行的转录组学和蛋白质组学比较，代谢组学具有以下优点：①基因和蛋白质表达的微小变化会在代谢物上得到放大，从而使检测更容易；②代谢组学的研究不需建立全基因测序及大量表达序列标签的数据库；③代谢物的种类远小于基在中医学的研究方面，辨证论治思维方式与代谢组学对疾病的研究方法具有相似之处，两者都遵从人体是一个有机整体，通过整合已经发生结果的生物体系输出的多维信息，逆向分析其内在的动态联系[3]。由于代谢组学从整体上反映生物体的功能水平与中医的整体思想高度趋同，并且代谢组学在整体研究的同时可以做到精细测量，这正是中医学证候概念无法从微观上解读、难以突破的关键问题所在，而代谢组学研究方法为从微观解读中医证候提供了可能的方法[4]。近年来，代谢组学发展迅速，广泛应用于中医药研究领域，为研究中医学提供了新的思路和研究平台。 2 代谢组学在中医基础理论研究中的应用

从中西医结合角度来看，当病邪入侵时，机体的各组分在结构、功能上会发生紊乱，并导致整体机能平衡的失调，即表现为体质、证候变化的代谢产物。这些代谢产物主要存在于唾液、尿液和血液等体液中，因此，对这些液体进行代谢物组成的检测和分析，就有可能了解疾病发生和发展过程中伴随的生物化学变化，从而发现相关疾病发生过程中变化的异常代谢物，为采取有效的预防和治疗措施提供相应依据。疾病的发展过程首先是从生理体质向病理体质过渡，再向病证发展的动态演变过程[5]。因此，对体质与证候的研究一直是中医学最主要最广泛的研究项目。 2.1 体质研究

体质是指人体生命过程中，在先天禀赋和后天获得基础上所形成的综合且相对稳定的特殊状态，这种特殊状态往往决定着其对某种致病因子的易感性及其所产生病变类型的倾向性[6]。此外，体质与人体的心理状况密切相关，这是中医“形神合一”思想在中医体质理论中的具体体现[7]。中医认为，形成体质的最直接因素是脏腑经络、气血阴阳、津液的相对稳定

的盛衰偏颇，当此种偏颇发展到一定程度时，即形成相应的疾病状态。在此过程中，机体代谢物会不断发生变化，由于代谢物能够反映细胞所处的环境，且代谢组学能反映确实已经发生了的事情[8]，因此，用现代分析技术对代谢物进行检测，获得异常的特征性代谢表达图谱，或许能够较准确地得知中医各种体质的物质基础，从而将体质的判定以多维多息图谱的形式在代谢物水平上进行量化标准化。

代谢组学技术强调把人作为一个完整的系统来研究，通过测定生物体系受刺激或扰动后其代谢产物的变化或其随时间的变化来研究该生物体代谢网络在疾病和药物作用下的变化[9]。由于代谢组学研究方法与中医具有相同的思维模式，已有学者借助其在中医体质辨别分型及体质的本质研究中取得了一定成绩。如李氏等[10]采用基于核磁共振的代谢组学方法研究了中医阳虚体质及平和体质（正常对照）的血清和尿液，分析了阳虚体质的特征代谢物。实验收集阳虚体质及平和体质各30例的血清及尿液样品，采用多元统计分析方法研究了阳虚质组和对照组血清与尿液中的内源性代谢差异。结果阳虚质血清中乳酸、极低密度脂蛋白/低密度脂蛋白、n-乙酰糖蛋白、脂肪酸及不饱和脂肪酸的含量降低，谷氨酰胺、葡萄糖、磷脂酰胆碱及高密度脂蛋白的含量增多；尿液中肌酐的含量降低，乳酸、二甲胺、柠檬酸及马尿酸含量增多。因此，阳虚体质的潜在生物标志物的发现从代谢组学角度为个体差异提供了新的依据。

当前社会困扰人类健康的一大问题为亚健康状态。而代谢组学在诊断不同类型亚健康体质方面有了很大进展。邱氏[11]运用核磁共振氢谱（1h-nmr）技术，分析了疲劳型亚健康及其不同体质的尿液代谢组学特征，结果发现α-酮戊二酸、丙氨酸、辅酶q、肌酸酐、磷酸肌酸、组胺、三磷酸甘油酸、鸟苷、马尿酸共10个变量有统计学意义，且均比健康组的表达水平升高；而疲劳型亚健康又有不同体质之分，其中平和质的肌酸酐，气虚质的肌酸酐、组胺、葡萄糖、丙氨酸、鸟苷、三磷酸甘油酸、磷酸肌酸、马尿酸、组氨酸、甘油酸，湿热质的肌酸酐、三磷酸甘油酸、丙氨酸、鸟苷、磷酸肌酸、α-酮戊二酸、辅酶q、葡萄糖、乳酸、乌头酸，可能为疲劳型亚健康相应体质的潜在标志性分子。这项研究从代谢组学角度对疲劳型亚健康不同体质的生物特征进行了探索，可能为疲劳型亚健康平和质、偏颇体质的表现特征、形成因素、发病倾向等机制提供新的解释。 一般而言，糖尿病在相当长的一段时间内没有明显症状，迄今对糖尿病前期状态的诊断也非常棘手。糖尿病是一种受环境因素和遗传背景影响的多因素的疾病，因每个人的生活方式是可变的，由此所造成的体质也是不同的。因此，对寻找糖尿病前期状态的潜在生物标志物，以达到早期检测和预防糖尿病的目的有着迫切要求。国外有学者对此进行了初步研究，他们利用小鼠的血浆、毛发、肝、肾等生物样本进行了基于代谢产物的分析研究。结果发现，所有的生物标本都含有n-乙酰基-l-亮氨酸这种内源性化合物，他们认为这种代谢产物似乎是一个与糖尿病有关的潜在生物标志物的候补，而其他潜在生物标志物的结构仍然尚未确定[12]。该研究使用了高效液相色谱-电喷雾电离质谱技术对代谢产物进行分析研究，可能对了解各种疾病的异常状态有所帮助。另外，还有研究从饮食改变上对尿液进行了代谢组学研究，他们对实验者的饮食进行高或低蛋白干预，77个超重非糖尿病受试者先进行为期8周的低卡路里饮食，然后被随机分配到一个高蛋白饮食组或低蛋白饮食组6个月，并收集了干预前和干预后的24 h尿液样本，利用1h-nmr和化学计量学进行尿液代谢物分析。结果显示，三甲胺氧化物与尿素氮息息相关。此外，还发现高蛋白饮食组的尿肌酸增加，而低蛋白饮食组的柠檬酸增加[13]。这项研究或许可以为体质的改变提供饮食方面的建议。 2.2 证候研究

“证”是机体在疾病发展过程中某一阶段的病理概括，它包括了病变的部位、原因、性质，以及正邪关系，反映疾病发展过程中某一阶段的病理变化的本质[14]。每一个证都有其外候与内涵，外候是疾病及其病理的外在表现，是中医通过四诊所获得的信息经过思考和整

理而得到的心得，它很大程度上依赖于医生的诊疗水平和对疾病的心得体会，具体辨证诊察时亦受到医患双方主观因素的影响而难以客观化和量化，如果能够对“证”的内涵进行研究和阐述，则应当能够避免人为主观因素的误诊[15]。而从中西医结合医学的角度来看，中医证本质的含义是指引起“证”发生、发展的物质基础，这些物质决定着证候发生发展的动态变化过程，是在证的发生发展过程中产生的特殊物质群[16]。代谢组学技术强调把人作为一个完整的系统来研究，这种依赖于高科技的研究方法不但与中医司外揣内的思想相吻合，还可以提高诊治的科学化，从而避免人为因素导致的误诊。因此，对于“证”的研究可以和处于科学前沿的代谢组学研究方法相结合，将“证”的研究推向科学发展的前沿。

目前，国内已有学者应用代谢组学研究中医证候的科学内涵，这些研究结果有力地证明了证候与正常健康状态之间确存在着代谢产物谱的差异。崔氏等[17]对亚健康脾虚证患者与健康人的尿液进行了代谢组学分析，从1h-nmr图谱及模式识别分析可见，2组尿液样本之间代谢产物谱存在显著差异。与正常组相比，亚健康脾虚证1h-nmr图谱中3-羟基丁酸、乳酸、甘氨酸、肌酐、马尿酸的含量低于正常组，而氧化三甲胺、柠檬酸的含量高于正常组，以上有谱峰变化的差异性代谢物可能为亚健康脾虚证的早期生物标志物。钱氏等[18]通过基于气-质联用（gc-ms）技术的尿液代谢组学预处理方法，对慢性肾功能衰竭患者与正常对照组尿液样本进行了代谢组学研究。对所有样本采用以葵酸作为内标的硅烷化衍生反应及gc-ms分析测试方法得到谱图之后，通过层次聚类分析和主成分分析及感受性曲线，比较慢性肾功能衰竭与正常对照组之间谱峰的差异性，发现慢性肾功能衰竭患者和正常人的尿液样本中，肌醇、l（-）-阿卓糖、d-呋喃木糖、己糖醇、核糖酸、2-甲氧羰基-3-甲基- 3-丁烯酸甲酯、丙酸、廿二烷这8个峰有显著差异。结果显示，gc-ms能为慢性肾功能衰竭的物质基础进行标志物的筛选及慢性肾功能衰竭诊断研究提供一定的科研思路与方法。张氏[19]利用代谢组学技术对冠心病心绞痛痰浊证、血瘀证的血液、尿液成分进行了对比分析，并对气滞血瘀证、心血瘀阻证、气虚血瘀证3种血瘀证进行了初步研究，结果显示，冠心病心绞痛痰浊证患者与冠心病心绞痛血瘀证患者血清能够被区分，2组血浆代谢物含量存在明显差异。冠心病心绞痛痰浊证患者与冠心病心绞痛血瘀证患者2组尿液1h-nmr的偏最小二乘判别分析（pls-da）结果显示，二者能够被区分，2组尿液样本之间的代谢物含量存在明显差异。冠心病心绞痛3种血瘀证的血浆代谢组学的pls-da结果显示，与健康人相比，心绞痛血瘀证患者血浆成分含量有较大改变。气虚血瘀证组与其他2个血瘀证组差别较大，而气滞血瘀证与心血瘀阻证差别不明显。这项研究结果体现了血液与尿液代谢物的变化能在一定程度上区分冠心病心绞痛的不同中医证型，但某些证型的区分或许还要运用不同的技术。王氏[20]对慢性阻塞性肺疾病（copd）肺气虚、肺阴虚患者的呼出气冷凝液（ebc）进行代谢组学研究，发现基于gc-ms检测的ebc代谢组学可以区分copd患者与正常人，2，4，4-三甲基-1，3-双异丁酸戊酯、7，9-二叔丁基-1-氧杂螺[4，5]-癸-6，9-二烯-2，8-二酮-邻苯二甲酸二异丁酯可能是copd潜在的疾病生物标记物。该技术亦可区分copd肺气虚组与肺阴虚组，雪松醇可能是潜在的肺阴虚证的生物标记物。由此可见，ebc可用于copd疾病及中医证型的临床客观指标诊断的研究，基于代谢组学的研究方法可以发现中医肺气虚证、肺阴虚证的客观化依据，是中医证型本质的研究手段之一。

在人体研究不断发展的同时，动物实验亦为代谢组学的发展作出了众多贡献。动物实验研究是医学临床研究的基础，通过构建相应的动物模型，分析、验证、解释中医临床证候与相关指标的关系，找出该证候的特异性指标，揭示证候的病理本质，对中医证候的规范化、现代化具有重要意义[21]。代谢组学能够在动物模型建立方面发挥重要作用。徐氏等[22]采用慢性束缚的方法造成肝郁证大鼠模型，运用1h-nmr技术对2组大鼠血清进行代谢组学分析。结果显示，造模过程中模型组对糖水的偏好摄入少于对照组（p 3 问题与展望

近年来，代谢组学在中医基础理论的研究中已逐步显示出其独特的优势，在中医证候、

中医体质等方面的研究显露出广泛的应用前景，为中医药研究提供了一种非常有用的技术手段，为中医现代化研究提供了一个新的机遇。但目前代谢组学在中医方面的研究仍处于初级阶段，而且，不同的分析法找到的标记物不同[24]，需要结合多种分析和技术进行研究，因此，对技术方面还有很高的要求。并且，目前对代谢物与基因、蛋白功能及整体生物学功能状态之间的联系的认识还相当局限，所以，迄今的研究还存在很大的技术和研究思路的挑战[25]。笔者认为，随着科学技术的不断发展，各种技术难题的不断解决，今后各种组学的数据将会成功对接，从更整体的变化规律上揭示中医学的本质，推动中医学事业的现代化发展。