【典型案例】
图1 啤酒生产线 图2 石油泄漏污染海湾
案例1：酶制剂在啤酒生产中的应用
酶制剂在啤酒生产中的应用较为普遍，酶制剂的利用，能降低啤酒生产本钱，在液化、糖化、啤酒澄清、防腐和避免老化进程中应用成效明显。辅料淀粉的液化一样选用 a-淀粉酶，a-淀粉酶可将淀粉液化成可溶于水的糊精、低聚糖、麦芽糖和葡萄糖。糖化进程中，辅料的糊化醪（液化）和麦芽中淀粉受到麦芽中水解酶及外加酶制剂作用，形成以麦芽糖为主的可发酵性糖。这一进程添加的酶有：β-淀粉酶、糖化酶、支链淀粉酶、半纤维素酶等。啤酒在贮存进程中，由于环境条件的作用，如光照、氧气、震动等，会产生浑浊、沉淀等现象。此类浑浊的形成，和啤酒中残留的蛋白质关系紧密，严峻阻碍啤酒的质量和在市场上的竞争力。添加蛋白酶可分解啤酒中的大分子蛋白质，有效去除啤酒中的沉淀物，澄清进程中要紧用到的酶有木瓜蛋白酶、、生姜蛋白酶和中性蛋白酶。超氧化物歧化酶和葡萄糖氧化酶可避免啤酒中风味老化物质的前提被氧自由基氧化而造成啤酒老化。同时，为了啤酒防腐保鲜，可在啤酒生产的发酵期、包装进程中添加少量溶菌酶，溶菌酶可作用于革兰氏阳性菌细胞胞壁的 N-乙酰胞壁酸与N-脱氢基葡萄糖之间β-1,4糖苷键，从而破坏细菌细胞壁，使细菌溶解死死亡，但对啤酒酵母
不起作用。
案例2：酶制剂在石油废水处置中的应用
石油是含有多种烃类（正烷烃、支链烷烃、芳烃、环烃）及少量其他有机物（硫化物、氮化物、酸类）的复杂混合物。2021年末发生的黄岛石油管道爆炸事件致使胶州湾近1万平方米海域受到石油污染，每一年因油轮出事、油田漏油、喷井等事故流入海洋的石油污染物约有1万万吨。目前针对石油生物降解要紧集中于具有较强降解能力的菌株的挑选上，但是这些微生物在海水中的繁衍受各类环境条件的阻碍，繁衍率很低。石油烃降解酶的分离纯化不仅是石油降解工程菌构建的基础，还可直接用于石油的生物降解，提高石油生物降解的效率。目前经常使用的石油烃降解酶包括甲烷单加氧酶、环羟基化双加氧酶、邻苯二酚双加氧酶、萘双加氧酶等。
以上是酶工程技术在食物生产技术和环境爱惜方面的二个案例。通过普遍学习和调研，咱们还能够了解更多的酶工程技术在咱们日常生活中发挥的重要作用。
学习指南 本章主要介绍酶工程技术，希望通过本章的学习，读者可以了解酶工程技术的研究
意义及发展现状；掌握酶与酶工程的概念和酶的生产技术、分离纯化技术；重点掌握酶第一节 概述
一、酶的概念及酶的研究意义
酶是具有生物催化功能的生物大分子，依照其化学组成，能够分为蛋白质类
酶（P酶）和核酸类酶（R酶）。蛋白类酶要紧由蛋白质组成，核酸类酶要紧由核糖核酸（RNA）组成。
目前已发觉的酶有7000种以上。它们散布于细胞的不同细胞器中，催化细胞生长代谢进程中的各类生物化学反映。在直径不足2µm的细菌细胞中，就有1000多种酶参与生物催化反映。细胞生命代谢中的化学反映都是在酶的催化作用之下进行的。没有酶的存在，生命就会停止。
酶与生物科学紧密相关。酶既是分子生物学研究的重要对象，又是研究生物学的重要工具。酶作为基因的切割工具具有独到的作用，它能够用于基因分离与重组。在基因工程研究中，多种工具酶接踵发觉，使得基因体外操作成为现实。工具酶成为基因工程的三大重要支撑技术之一。
对酶的深切研究推动了多种学科的进展，产生了多个交叉新学科。20世纪以来，前后形成了生物化学、生物技术、生物有机化学、生物无机化学、和仿生学等。其中生物技术占有核心地位，其研究与应用推动了工业、农业、食物环保、医药卫生乃至国防航天事业的快速进展，成为21世纪进展的主导学科之一。酶工程作为生物技术的分支，在上述领域的进展中起到了十分重要的作用。 二、酶的研究简史
据资料记载，4000连年前的夏禹时期已经显现酿酒技术，酒是酵母发酵的产物，是酵母细胞内酶作用的结果。公元10世纪，我国人民发明了通过霉菌发酵将豆类做成豆酱；3000年前利用麦曲制造饴糖和利用曲类医治消化不良都是利用淀粉酶和水解酶的作用。
真正显现酶的概念是1878年。那时德国的Kuhne将从麦芽中分离出来的一种能够水解淀粉的物质称为“Enzyme”，后来被翻译为“酶”。1896年德国人
Buchner兄弟发觉酵母的破碎细胞分离液体与完整酵母一样具有将葡萄糖降解为乙醇和二氧化碳的作用，他们将该物质称为酒化酶。因此比较公认的观点是，酶学的研究是从1896年Buchner兄弟的实验开始的。
20世纪初，酶学取得了迅速进展。一是发觉酶的种类愈来愈多，二是开展了对酶的作用机理研究，如酶反映的条件与反映机制等，同时发觉了辅酶在酶催化反映中的重要意义。Michaelis Menton于1913年提出了酶促反映动力学原理——米氏学说。1926年，Summer从刀豆中取得脲酶结晶，通过反复实验证明，酶本身确实是一种蛋白质。在后来取得多种酶的结晶后人们同意了Summer的结论。1947年Summer取得诺贝尔化学奖。与此同时，运用X射线衍射分析，人们接踵弄明确了溶菌酶、胰凝乳蛋白酶等多种酶的结构和作用机制。
20世纪中期，针对酶在反映中表现出来的相对专一性和绝对专一性，Koshland提出了“诱导契合”学说。Monod提出了“变构模型”，说明了酶的调控机制。
1969年我国科学家第一次人工合成具有生物活性的牛胰岛素，这一成绩成为酶学研究的重要里程碑。
基因工程技术的诞生为酶的研究和进展带来了一次重要的机缘。DNA定点突变技术能够改变酶的活性及专一性。专门是酶活性中心的氨基酸残基的转变对酶的作用是十分显著的。
1982年，Cech等人发觉核酸也具有生物催化功能。“核酶”（ribozyme）概念的显现关于传统的“酶是具有催化功能的蛋白质”的表述是极大的挑战。人们同意了核酸具有催化功能的事实，最终将酶概念为“酶是具有生物催化功能的生物大分子”。
此刻酶的应用领域愈来愈广。食物工业、医药卫生、轻纺化工、环保等领域都是酶的重点开发方向。酶的应用改变了人们的生活。如在日常生活中利用的加酶洗衣粉，同一样的洗衣粉相较，加酶洗衣粉中含有蛋白质和脂肪酶等多种酶，
去除汗渍和油污的能力比传统的洗衣粉强了许多倍。酶的应用同时增进了酶工程的进展。 三、酶工程技术
所谓酶工程，确实是在必然的生物反映器中，利用酶的催化作用，将相应的原料转化成有效物质的技术。而且酶工程在生物工程占极为重要的地位，没有酶的作用，任何生物工程技术都不能实现。
归纳地说，酶工程包括酶制剂的生产和应用两个方面。
尽管已知酶的种类约7000多种，但实际已被运用于工业生产的仅10余种。已经能够实现工业化生产的酶有淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、葡萄糖异构酶等，其中碱性蛋白酶用于加酶洗涤剂，占酶销售额的首位，青霉素固化酶用于医疗，占世界用量的第二位。
在初期酶制剂要紧来源于动植物材料，今天酶的来源要紧来自微生物。生产酶制剂的进程包括酶的产生、提取、纯化和固定化等步骤。 1.酶的产生、提取和纯化
（1）酶的产生 酶普遍存在于动物、植物和微生物体内。人们最先是从植物的器官和组织中提取酶的。例如，从胰脏中提取蛋白酶，从麦芽中提取淀粉酶；此刻，酶多数来自微生物发酵生产，这是因为同植物和动物相较，微生物具有容易培育、繁衍速度快和便于大规模生产等优势。只要提供必要的条件，就能够够利用微生物发酵来生产酶。
（2） 酶的提取和纯化 从微生物、动植物细胞中取得含有多种酶的提取液后，为了从混合液中取得所需要的某一种酶，必需将提取液中的其他物质分离，以取得纯化酶的目的。 2.酶的固定化
酶固定化技术是先将纯化的酶连接到必然的载体上，利历时将被固定的酶投放到反映溶液中，催化反映终止后又能将被固定的酶回收。
固定化酶的技术是1969年日本第一研制成功，此刻该方式已经应用到多种酶的生产中。固定化酶一样是呈膜状、颗粒状或粉状的酶制剂，它在必然的空间范围内催化底物反映。 3.固定化细胞
利用胞内酶制作固定化酶时，先要把细胞打坏，才能将里面的酶提掏出来，这就增加了酶制剂生产的工序和本钱。直接固定细胞一样能够提供咱们所需的酶（胞内酶），因此固定化细胞一样能够代替酶进行催化反映。例如，将酵母细胞吸附到多孔塑料的表面上或包埋在琼脂中，制成的固定化酵母细胞，能够用于酒类的发酵生产。 四、酶制剂的应用
目前随着酶工程技术的进展，酶已经普遍应用于医药卫生、食物加工、环境爱惜和轻化工业上。如在医药上胰岛素作为医治糖尿病的经常使用药品；尿激酶能够用来活化人体内的溶纤维蛋白酶原，使溶纤维蛋白酶原转化为溶纤维蛋白酶，溶化血栓，医治脑溢血、心肌梗塞、肺动脉阻塞等心脑血管疾病。在食物加工上，利用酶制剂生产产品，能够提高生产效率。如酿酒厂和饮料厂利用果胶酶来澄清果酒和果汁；如用葡萄糖氧化酶能够除去密封饮料和罐头中的氧气，从而有效地避免饮料和食物氧化变质；再如，用木瓜蛋白酶制成的嫩肉粉，能够使肉丝、肉片等烹饪后吃起来嫩滑可口等等。在环境爱惜上，利用固定化多酚氧化酶研制成多酚氧化酶传感器，快速测定出炼油和炼焦工厂排放到河流和湖泊水中的酚量。在化学纺织工业等方面，应用蛋白酶，既加速皮革的浸水、脱毛、软化进程， 改变旧工艺脏、累、臭的状况；在纺织方面，一些纺织原料也能够利用酶制剂进行加工；利用蛋白酶对天然蚕丝进行脱胶，脱胶后的蚕丝具有鲜亮的色泽和柔滑的手感。
酶的应用例子很多，将在后续的章节中重点介绍。
第二节 酶的发酵生产
商业用酶来源于动植物组织和某些微生物。传统上由植物组织提供的酶有蛋白酶、淀粉酶、氧化酶和其他酶，由动物组织提供的酶要紧有胰蛋白酶、脂肪酶和凝乳酶。可是，从动物组织或植物组织大量提取的酶，常常会涉及到技术、经济和伦理上的问题，许多传统的酶源已远远不能适应现今世界对酶的需求。为了扩大酶源，人们正愈来愈多地求助于微生物。
微生物作为酶生产的要紧来源有以下缘故。
①生物生长繁衍快，世代时刻短，产量高。②微生物培育方式简单，生产原料来源丰硕，价钱低廉，机械化程度高,经济效益高。③微生物菌株种类繁多，
酶的品种齐全。④微生物有较强的适应性和应变能力，能够通过适应、诱导、诱变及基因工程等方式培育出新的产酶菌种。
尽管如此，但能够用于酶工业化生产的微生物种类仍是十分有限的。主若是利用未经查验的微生物进行生产存在产品毒性与平安性问题。基于那个缘故，目前大多数工业微生物酶的生产，都局限于利用仅有的极少数的真菌或细菌。第二，产酶菌株的挑选也有较严格的标准。 一、产酶优良菌种的挑选 1. 优良菌株的标准
优良的产酶菌种是提高酶产量的关键，挑选符合生产需要的菌种是发酵生产酶的首要环节，一个优良的产酶菌种应具有以下特点： （1）繁衍快、产量高、生产周期短。 （2）适宜生长的底物低廉易患。
（3）产酶性能稳固、不易退化、不易受噬菌体侵袭。 （4）产生的酶容易分离纯化。
（5）平安靠得住，非致病菌，可不能产生有毒物质。 2．挑选进程
产酶菌种的挑选方式要紧包括以下几个步骤：含菌样品的搜集，菌种分离，产酶性能测定及复筛等。关于产生胞外酶的菌株，常常采纳分离、定性和半定量测定相结合的方式，在分离时就大体能够预测菌株的产酶性能。
胞外酶产酶菌株的挑选操作如下：将酶的底物和培育基混合倒入培育皿中制成平板，然后将待测菌涂布在培育基表面，若是菌落周围的底物浓度发生转变，即证明它产酶。
若是是产生胞内酶的菌株挑选，那么可采纳固体培育法或液体培育法来确信。①固体培育法。将菌种接入固体培育基中保温数天，用水或缓冲液将酶抽提，测定酶活力，这种方式要紧适用于霉菌。②液体培育法。将菌种接入液体培育基后，静置或振荡培育一段时刻(视菌种而异)，再测定培育物中酶的活力，通过比较，挑选出产酶性能较高的菌种继续挑选。 3.产酶经常使用的微生物
依照产酶微生物的挑选标准，经常使用的产酶微生物有以下几类： （1）细菌 细菌是工业上有重要应用价值的原核微生物。在酶的生产中，经常
使用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。大肠杆菌能够用于生产多种酶，如谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、青霉素酰化酶等；枯草芽孢杆菌能够生产α-淀粉酶、蛋白酶、碱性磷酸酶等。
（2）放线菌 经常使用于酶发酵生产的放线菌主若是链霉菌。链霉菌是生产葡萄糖异构酶的要紧微生物，同时也能够生产青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。
（3）霉菌 霉菌是一类丝状真菌，用于酶生产的霉菌要紧有黑曲霉、米曲霉、红曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉等，生产的酶种类有糖化酶、果胶酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核酸核糖酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶、凝乳酶等20多种酶。
（4）酵母 经常使用于产酶的酵母有啤酒酵母和假丝酵母。啤酒酵母除要紧用于啤酒、酒类的生产，此外，还能够用于转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶的生产；假丝酵母能够用于生产脂肪酶、尿酸酶、转化酶等。 二、基因工程菌株(细胞)
基因工程技术能够将未经批准的产酶微生物的基因或由生长缓慢的动植物细胞产酶的基因，克隆到平安的、生长迅速的、产量很高的微生物体内，形成基因工程菌株，然后发酵生产。基因工程技术还能够通过增加基因的拷贝数，来提高微生物产生的酶数量。目前，世界上最大的工业酶制剂生产厂商丹麦诺维信公司(Novozyme)，生产酶制剂的菌种约有80%是基因工程菌。至今已有100多种酶基因克隆成功，包括尿激酶基因、凝乳酶基因等。
要构建一个具有良好产酶性能的基因工程菌株，必需具有良好的宿主-载体系统。
理想的宿主应具有以下几个特性：
体与宿主相容，携带酶基因的载体能在宿主体内稳固维持； ②菌体容易大规模培育，生长无特殊要求，且能利用廉价的原料； ③所产生的目标酶占总蛋白量的比例较高，且能以活性形式分泌； ④宿主菌对人平安，不分泌毒素。
自然界蕴藏着庞大的微生物资源，在发觉的微生物中，有99%的微生物是在实验室内利用常规的培育方式培育不出的微生物。此刻人们能够采纳新的分子生物学方式直接从这种微生物中探讨和寻觅有开发价值的新的微生物菌种、基因和
酶。目前科学家们热衷于从极端环境条件下生长的微生物中挑选新的酶，要紧研究嗜热微生物、嗜冷微生物、嗜盐微生物、嗜酸微生物、嗜硫微生物和嗜压微生物等。这就为新酶种和酶的新功能开发提供了广漠的空间。目前在嗜热微生物的研究方面取得了可喜的进展，例如耐高温的淀粉酶和DNA聚合酶等已取得普遍的应用。
三、微生物酶的发酵生产
微生物酶的发酵生产是指在人工操纵的条件下，有目的地利用微生物培育来生产所需的酶，其技术包括培育基和发酵方式的选择及发酵条件的操纵治理等方面的内容。 1.培育基
(1)碳源 碳源是微生物细胞生命活动的基础，是合成酶的要紧原料之一。工业生产上应考虑原料的价钱及来源，通常利用各类淀粉及它们的水解物如糊精、葡萄糖等作为碳源。在微生物发酵中，为减少葡萄糖所引发的分解代谢物的阻遏作用，采纳淀粉质材料或它们的不完全水解物比葡萄糖更有利。一些特殊的产酶菌需要特殊的碳源才能产酶，如利用黄青霉生产葡萄糖氧化酶时，以甜菜糖蜜作碳源时不产生目的酶，而以蔗糖为碳源时产酶量显著提高。
(2)氮源 氮源可分为有机氮和无机氮。选用何种氮源因微生物或酶种类的不同而不同，如用于生产蛋白酶、淀粉酶的发酵培育基，多数以豆饼粉、花生饼粉等为氮源，因为这些高分子有机氮对蛋白酶的形成有必然程度的诱导作用；而利用绿木霉生产纤维素酶时，应选用无机氮为氮源，因为有机氮会增进菌体的生长繁衍，对酶的合成不利。
(3)无机盐类 有些金属离子是酶的组成成份，如钙离子是淀粉酶的成份之一，也是芽孢形成所必需的金属离子。无机盐一样在低浓度情形下有利于酶产量的提高，而高浓度那么容易产生抑制。
(4)生长因子 生长因子是指细胞生长必需的微量有机物，如维生素、氨基酸、嘌呤碱、嘧啶碱等。有些氨基酸还能够诱导或阻遏酶的合成，如在培育基中添加大豆的酒精抽提物，米曲霉的蛋白酶产量可提高约2倍。
(5)pH值 在配制培育基时应依照微生物的需要调剂pH。一样情形下，多数细菌、放线菌生长的最适pH为中性至微碱性，而霉菌、酵母那么偏好微酸性。培育基的pH不仅阻碍微生物的生长和产酶，而且对酶的分泌也有阻碍。如用米曲
霉生产α-淀粉酶，当培育基的pH由酸性向碱性偏移时，胞外酶的合成减少，而胞内酶的合成增多。 2.酶的发酵生产方式
酶的发酵生产方式有两种，一种是固体发酵，另一种是液体深层发酵。固体发酵法用于真菌的酶生产，其顶用米曲霉生产淀粉酶，和用曲霉和毛霉生产蛋白酶在我国已有悠长的历史。这种培育方式尽管简单，可是操作条件不易操纵。随着微生物发酵工业的进展，此刻大多数的酶是通过液体深层发酵培育生产的。液体深层培育应注意操纵以下条件：
(1)温度 温度不仅阻碍微生物的繁衍，而且也显著阻碍酶和其他代谢产物的形成和分泌。一样情形下产酶温度低于最适生长温度，例如酱油曲霉蛋白合成酶合成的最适温度为28℃，而其生长的最正确温度为40℃。
(2)通气和搅拌 需氧菌的呼吸作用要消耗氧气，若是氧气供给不足，将阻碍微生物的生长发育和酶的产生。为提高氧气的溶解度，应付培育液加以通气和搅拌。可是通气和搅拌应适当，以能知足微生物对氧的需求为妥，过度通气对有些酶（如青霉素酰化酶）的生产会有明显的抑制作用，而且猛烈搅拌和通气容易引发酶蛋白变性失活。
(3)pH的操纵 在发酵进程中要紧密注意操纵培育基pH的转变。有些微生物能同时产生几种酶，能够通过操纵培育基的pH以阻碍各类酶之间的比例，例如当利用米曲霉生产蛋白酶时，提高pH有利于碱性蛋白酶的形成，降低pH那么要紧产生酸性蛋白酶。 3.提高酶产量的方法
在酶的发酵生产进程中，为了提高酶的产量，除选育优良的产酶菌株外，还能够采纳其他方法，例如添加诱导物、操纵阻遏物浓度等。
(1)添加诱导物 关于诱导酶的发酵生产，在发酵培育基中添加诱导物能使酶的产量显著增加。诱导物一样可分为三类：①酶的作用底物，例如青霉素是青霉素酰化酶的诱导物；②酶的反映产物，例如纤维素二糖可诱导纤维素酶的产生；③酶的底物类似物，例如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对β-半乳糖苷酶的诱导成效比乳糖高几百倍。而利用最普遍的诱导物是不参与代谢的底物类似物。 (2)降低阻遏物浓度 微生物酶的生产会受到代谢结尾产物的阻遏和分解代谢物阻遏的调剂。为幸免分解代谢物的阻遏作用，可采纳难于利用的碳源，或采纳分
批添加碳源的方式使培育基中的碳源维持在不至于引发分解代谢物阻遏的浓度。例如在β-半乳糖苷酶的生产中，只有在培育基中不含葡萄糖时，才能大量诱导产酶。关于受结尾产物阻遏的酶，可通过操纵结尾产物的浓度使阻遏解除。例如，在组氨酸的合成途径中，10种酶的生物合成受到组氨酸的反馈阻遏，假设在培育基中添加组氨酸类似物，如2-噻唑丙氨酸，可使这10种酶的产量增加10倍。 (3)表面活性剂 在发酵生产中，非离子型的表面活性剂常被用作产酶增进剂，但它的作用机制尚未明确；可能是由于它的作用改变了细胞的通透性，使更多的酶从细胞内透过细胞膜泄漏出来，从而打破胞内酶合成的反馈平稳，提高了酶的产量。另外，有些表面活性剂对酶分子有必然的稳固作用，能够提高酶的活力，例如利用霉菌发酵生产纤维素酶，添加1%的吐温可使纤维素酶的产量提高几倍到几十倍。
（4）添加产酶增进剂 产酶增进剂是指那些能提高酶产量但作用机制尚未说明的物质，它可能是酶的激活剂或稳定剂，也可能是产酶微生物的生长因子，或有害金属的螯合剂，例如添加植物钙可使多种霉菌的蛋白酶和橘青霉的5ˊ-磷酸二酯酶的产量提高2-20倍。
第三节 酶的提取与分离技术
酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其他含酶原料中提掏出来，再与杂质分离，而取得所需酶的进程。要紧内容包括细胞破碎、酶的提取、离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电泳分离、萃取分离、浓缩、干燥、结晶等。 一、细胞破碎
除胞外酶外，绝大多数酶都存在于细胞内部。为了取得细胞内的酶，第一要搜集细胞、破碎细胞，让酶从细胞内释放出来，然后进行酶的提取和分离纯化。
细胞的破碎方式能够分为机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶促破碎法等。在实际应历时应当依照具体情形选择适宜的细胞破碎方式，有时也采纳两种或两种以上的方式联合利用，达到较好的破碎成效。
表5-1列出了几种细胞破碎方式及原理。
表5-1 细胞破碎方式及原理
分类 机械破碎法
细胞破碎方法 捣碎法 研磨法
细胞破碎原理
通过机械运动产生的剪切力，是组织、细胞破碎
匀浆法
物理破碎法
温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法
化学破碎法 酶促破碎法
添加有机溶剂 添加表面活性剂 自溶法 外加酶制剂法
通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，是细胞外层结构破坏，而使细胞破碎
通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而是细胞破碎 通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，从而使细胞破碎。
二、酶的提取
酶的提取是指在必然条件下，用适当的溶液或溶剂处置含酶原料，使酶溶解到溶剂中来，事实上确实是酶的抽提进程。
酶提取时，溶剂的选择与酶的结构和溶解性质有关。一样来讲，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶液中，碱性物质易溶于酸性溶液中。
依照酶的结构特点，绝大部份酶都能够溶于水中，通常能够采纳稀酸、稀碱、稀盐溶液提取；有些酶与脂类物质结合或带较多的非极性基团，那么采纳有机溶剂提取。
表5-2列出了提取酶的各类方式。
表5-2 酶的要紧提取方式
提取方法 盐溶液提取 酸溶液提取 碱溶液提取 有机溶剂提取
用于提取的溶剂 的盐溶液 pH2-6的水溶液 pH8-12的水溶液 可与水混溶的有机溶剂
提取的酶的性质 在低盐溶液中溶解度较大的酶
在稀酸溶液中溶解度较大且稳定性较好的酶 在稀碱溶液中溶解度较大且稳定性较好的酶 与脂类结合或者含较多非极性基团的酶
为了提高酶的提取效率并避免酶变性失活，在提取进程中要注意操纵温度、pH值等提取条件。 三、沉淀分离
沉淀分离是通过改变某些条件或添加某些物质，使酶的溶解度降低，从溶液中沉淀析出与其他溶质分离的技术进程。
沉淀分离的方式要紧有盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合
沉淀法等。
表5-3列出了各类沉淀法的分离原理。
表5-3 沉淀分离方式
沉淀分离方法 盐析沉淀法 等电点沉淀法 有机溶剂沉淀法 复合沉淀法
分离原理
利用酶（蛋白质）不同盐浓度下的溶解度不同的原理，使酶或者杂质析出沉淀，从而使酶与杂质分离
利用两性电解质在等电点时溶解度最低以及不同的两性电解质有不同的等电点的特性，调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离
利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的有机溶剂，使酶与杂质沉淀析出，使酶与杂质分离
在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离
四、离心分离
离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术进程。
依照离心机最大转速的不同，能够分为低速离心机、高速离心机和超速离心机三种。
低速离心机的最大转速在8000rpm。在酶的分离纯化中，要紧用于细胞、细胞碎片和培育基残渣等固形物的分离，也可用于酶的结晶等较大颗粒的分离。
高速离心机的最大转速为（）ｘ104 rpm。在酶的分离纯化进程中，要紧用于细胞碎片和细胞器的分离。为避免高速离心时产生高温致使酶变性失活，配置冷冻降温装置，称为高速冷冻离心机。
超速离心机的最大转速达到（）ｘ104 rpm。要紧用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子和细胞器和病毒的分离纯化；沉降系数和相对分子质量的测定等。超速离心机的要求较高，均配置有冷冻系统、控温系统、真空系统、制动系统和平安系统等。 五、过滤与膜分离
过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术进程。能够作为过滤介质的物质有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷和各类高分子膜等。依照过滤介质的不同，过滤能够分为膜过滤和非膜过滤。将粗滤及部份微滤采纳高分子膜之外的物质作为过滤介质，称为非膜过滤；而大部份微滤和超滤、反渗透、透析、电渗析等采纳各类高分子膜作为过滤介质，称为膜过滤或膜分离技术。
依照过滤介质截留的物质颗粒大小不同，过滤能够分为粗滤、微滤、超滤和反渗透等四大类。表5-4列出了它们的要紧特性。
表5-4 过滤的种类及特性
类别 粗滤 微滤 超滤 反渗透
截留的颗粒大小
>2µm µm 20 Å-2µm <20Å
截留的主要物质
过滤介质
酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等 滤纸、滤布、纤维多孔陶
瓷等
细菌、灰尘等 病毒、生物大分子等 生物小分子、盐、离子等
微过滤、微孔陶瓷 超滤膜 反渗透膜
六、层析分离
层析分离是利用混合液中各组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分派系数）的不同，使各组分以不同比例分派在两相中。其中一个相为固定的称为固定相，另一个为流动的称为流动相。当流动相流经固定相时，各组分以不同的速度移动，从而使不同的组分分离纯化。
分离酶经常使用的层析方式有吸附层析、分派层析、离子互换层析、凝胶层析和亲和层析等。表5-5列出各类层析方式采纳的依据。
表5-5 层析分离方式
层析方法 吸附层析 分配层析 离子交换层析 凝胶层析 亲和层析 层析聚焦
分离依据
利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离 利用各组分在两相中的分配系数不同而使各组分分离
利用离子交换剂上的可解离基团对各种离子的亲和力不同而达到分离的目的 以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中各组分的相对分子质量不同而使各组分分离 利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化 将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离
七、电泳分离
带电离子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的进程称为电泳。物质颗粒在电场中的移动方向为：带正电荷的颗粒向电场的阴极移动；带负电荷的颗粒那么向阳极移动；净电荷为零的颗粒在电场中不移动。颗粒在电场中的移动速度要紧取决于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和大小的阻碍。另外还受电场强度、溶液的pH值、离子强度及支持体的特性等外界条件的阻碍。
电泳的方式有多种。依照利用的支持体的不同，能够分为纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、自由电泳和等电聚焦电泳等。
在酶学研究中，电泳技术要紧用于酶的纯度鉴定、酶的分子质量测定、酶等电点测定和少量酶的分离纯化。 八、萃取分离
萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取中的两相一样为互不相溶的两个液相或其它流体。
依照两相的组成不同，萃取能够分为有机溶剂萃取、双水相萃取、超临界萃取等。
1. 有机溶剂萃取
有机溶剂萃取的两相别离为水相和有机溶剂相，利用溶质在水和有机溶剂中的溶解度不同而达到分离。用于萃取的有机溶剂要紧有乙醇、丙酮、丁醇、苯酚等。
2.双水相萃取
双水相萃取的两相别离为互不相溶的两个水相。利用溶质在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而达到分离。双水相萃取中利用的双水相一样是按必然比例组成的互不相溶的盐溶液和高分子溶液或两种互不相溶的高分子溶液组成。 3. 超临界萃取
超临界萃取又称为超临界液体萃取，是利用欲分离物质在超临界液体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。超临界流体的物理特性和传质特性介于液体和气体之间，具有和液体一样的溶解能力，其萃取速度很高；但其随温度和压力的转变，超临界流体转变成气体，使萃取的物质很容易从超临界流体中分离出来。在超临界流体中，不同的物质具有不同的溶解度，溶解度大的物质容易与溶解度少或不溶解的物质分离出来。目前在超临界萃取中最经常使用的超临界流体是CO2。CO2超临界点的温度为℃，超临界压力为,超临界密度为·ml-1。专门适合生物活性物质的提取和分离。 九、结晶
结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的进程。酶的结晶是酶分离纯化的一种手腕。酶在结晶之前，酶液必需通过纯化达到必然纯度和浓度。通常在50%以上的纯度才能结晶，纯度越高越容易结晶；一样，浓度也是结晶的一个很重要因素，浓度太低无法析出结晶。另外，在结晶进程中还要操纵好温度、pH值、离子强度等结晶条件，才能取得结构完整、大小均一的晶体。
结晶的方式很多，要紧有盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平稳结晶法和等电点结晶法等方式。其原理与本章中沉淀分离的原理类似。 十、干燥
干燥是将固体、半固体或浓缩液中的水分或其他溶剂除去一部份，以取得含水分较少的固体物质的进程。酶通过干燥后，能够提高酶的稳固性，利于产品保
留、运输和利用。经常使用的干燥方式有真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥和吸附干燥等。
本节课外阅读链接 纤维素酶的分离纯化
纤维素是地球上最丰硕的可再生性碳源物质，其降解是自然界碳素循环的中心环节。有效利用纤维素可有效解决能源危机和环境污染等重大问题。采纳纤维素酶进行水解是保证无污染地将这些纤维素物质转化成简单糖的关键，是纤维素被完全分解的有效途径。纤维素酶来源普遍，植物、微生物、软体动物、原生动物、昆虫等都能产纤维素酶。其组分较复杂，要紧有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶三种。不同组分的分子量和等电点大多不同，给纤维素酶分离纯化造成了必然的困难。因此，选择适宜的分离纯化方式是降低纤维素酶生产本钱、提高纤维素酶活力的要紧途径。
目前经常使用的纤维素酶的分离纯化法包括沉淀法、凝胶层析法、离子互换层析法、亲和层析法、疏水层析法、电泳分离和萃取分离法等。这些方式可单独作用来分离纯化纤维素酶，也可组合运用，以达到更好的分离成效。下面以沉淀法和层析法为例说明从黑曲霉中分离纯化纤维素酶的进程。
1.盐析沉淀
硫酸铵是盐析中最为经常使用的盐，具有可不能使蛋白质变性、盐析能力强、溶解度大等优势。分段硫酸铵盐析需要确信所需硫酸铵的饱和度区间和溶液的pH。因此在不同pH的酶液中加硫酸铵固体至不同饱和度，高速离心后，测沉淀的纤维素酶活力，以此确信最正确硫酸铵饱和度。
G-100 凝胶柱层析
取上述所得最正确相对饱和度硫酸铵盐析后的沉淀物，溶解于pH 的缓冲溶液中，用滴管警惕缓慢加入凝胶柱。滴管口伸入液面下位于柱中央，勿扰动上层凝胶。打开出液口，使酶液慢慢渗入凝胶。待酶液方才渗入凝胶时，关闭出液口，用滴管在距胶面2~3处沿柱壁慢慢加入缓冲液，在距胶面5cm时接上洗脱管，打开出液口，开始洗脱。测各搜集管中酶液的蛋白含量及内切酶酶活，以期对纤维素酶初酶液进行初步分离。凝胶层析法是以各类多孔凝胶为固定相，利用流动相
中各组分的相对分子质量不同而使各组分分离。但仅依照分子量大小的不同很难将纤维素酶各组分完全分开。因此需要采纳离子互换层析对分子量相近的成份进一步分离。
弱阴离子互换柱层析
1mL预装柱，缓冲液平稳DEAE-FF弱阴离子互换柱。将通过Sephadex G-100柱层析的内切酶峰值溶液，上阴离子互换柱。含1mol/L NaCl的上述平稳液进行梯度洗脱，洗脱速度为1 mL/min，分步搜集器自动搜集，每管1mL。对纤维素酶酶液进行进一步分离。离子互换层析法可进一步将凝胶层析法无法分离的酶组分进行分离，取得纯化倍数更高的酶。
纤维素酶的分离纯化工作超级重要，只有取得纯酶，才能了解其组成、性质及彼此关系，并可依照纤维素酶的不同理化性质，开展纤维素酶降解机制的研究，为减缓能源危机和操纵环境污染提供技术支持。
第四节 酶分子修饰
酶分子是具有完整的化学结构和空间结构的生物大分子。酶的结构决定了酶的性质和功能。当酶分子的结构发生改变时，将引发酶的性质和功能的改变。
酶分子完整的空间结构给予了酶分子的生物催化功能，使其具有催化高效性、作用专一性和反映条件温和等特点。但另一方面，也是因为酶的分子结构使酶具有稳固性差、活性不高和可能具有抗原性等弱点，限制了酶的应用。因这人们需要进行酶分子修饰的研究。
所谓酶分子修饰，确实是通过各类方式使酶分子结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术。
酶分子修饰的方式多种多样。归纳起来，酶分子修饰要紧包括金属离子置换修饰、大分子结合修饰、侧链基团修饰、肽链有限水解修饰、核苷酸链有限水解修饰、氨基酸置换修饰和酶分子物理修饰等。
下面介绍前三种方式。 一、金属离子置换修饰
将酶分子中的金属离子置换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方式称为金属离子置换修饰。
通过金属离子置换修饰，能够了解各类金属离子在酶催化进程中的作用，说明酶分子的催化作用机制，提高酶活力，增强稳固性，乃至改变酶的某些动力学性质。
有些酶分子中的金属离子，往往是酶活性中心的组成部份，对酶的催化功能起到超级重要的作用。如过氧化氢酶分子中的Fe2+,超氧化歧化酶分子中的Cu2+、Zn2+等。
假设从酶分子中除去所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。若是从头加入原有的金属离子，酶的催化活性能够恢复或部份恢复。假设用另一种金属离子进行置换，那么可使酶呈现出不同的特性。有的可使酶的活性降低乃至丧失，有的能够使酶的活性提高或增加酶的稳固性。如α-淀粉酶分子中大多数含有钙离子，有些含有镁离子或锌离子。假设将镁离子、锌离子置换为钙离子，那么结晶的钙型α-淀粉酶活力比一样结晶的杂型α-淀粉酶活力提高3倍以上。 二、大分子修饰置换
采纳水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性与功能的方式称为大分子结合修饰。
大分子结合修饰具有以下作用。 1.通过修饰提高酶活力
水溶性大分子与酶的侧链基团通过共价结合后，可使酶的空间构象发生改变，使酶活性中心更有利于与底物结合，并形成准确的催化部位，从而提高酶的活力。例如每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶的活力提高倍。 2.通过修饰增强酶的稳固性
酶的稳固性能够用酶的半衰期表示。酶的半衰期长，说明酶的稳固性好，反之那么差。不同的酶具有不同的半衰期。如超氧化歧化酶在人体血浆中的半衰期只有6-30分钟。而通过聚乙二醇修饰后，半衰期提高到35小时。 3.排除酶蛋白的抗原性
对人体来讲，来源于动植物或微生物细胞的酶是一种外源蛋白，往往具有抗原性。进入人体会刺激产生抗体。抗体与抗原结合会使酶失去催化功能。通过酶分子结构修饰，能够降低乃至排除抗原性。如具有抗癌作用的精氨酸酶通过聚乙二醇结合修饰，生成聚乙二醇-精氨酸酶后其抗原性消失，使精氨酸酶专门好地发挥了抗癌效能。
三、酶分子的侧链基团修饰
采纳必然的化学方式使酶分子的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方式称为侧链基团修饰。
酶的侧链基团修饰能够用于研究酶分子的结构与功能。如侧链基团对酶分子活力与稳固性的阻碍；对酶的功能的奉献及测定某一基团在酶分子中的数量。
酶的侧链基团修饰的方式很多，要紧有氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰、胍基修饰、酚基修饰、咪唑基修饰、吲哚基修饰、分子内交联修饰等。
第五节 酶的固定化
酶的固定化能够通过量种形式实现。固定化酶、固定化细胞、固定化原生质体都是酶的固定化形式。通常将未经固定的酶或细胞称为游离酶（天然酶）或细胞，固定的酶称为固定化酶 ，固定的微生物细胞称为固定化细胞。固定化酶(细胞)用于发酵可称为固定化酶(细胞)发酵，或简称固定化发酵。一、固定化的优势
将酶固定在载体上形成固定化酶具有如下优势：
①固定化酶（细胞）能够重复利用。 游离酶(细胞)与底物作用是一次性的，非持续性的发酵罐发酵也是一次性的，而固定化酶（细胞）与反映物作用可多次利用，有的可达几十、几百次，乃至持续利用几年，尤其是固定化细胞，能够看做是固定化细胞的持续发酵，极大地提高了生产效率，如用固定化梭状芽胞杆菌厌氧条件下持续发酵生产正丁醇和异丙醇，已取得产率高出分批发酵4倍的产量。 ②产物的分离、提纯等后处置比较容易。游离酶与产品混在一路难分离，发酵的产品与大量的菌体和非需要的产物混在一路，分离、纯化工艺难度较大，利用固定化酶和细胞的产物相对少地含有非需要产物和菌体，产品分离容易。 ③固定化酶（细胞）一样都做成了球形颗粒或薄片状，使产品的生产工艺操作简化，易于实行机械化和自动化操作，所需的设备和器材也较简易。
④固定化酶（细胞）能够制成酶活力很高或细胞密度专门大，而且抗酸、碱、温度转变的性能高，酶活性较稳固。因此反映速度加速，生产周期缩短。 ⑤固定化酶与固定化细胞相较，各有所长。固定化酶相对产物更单一，非需要的产物更少些，生产操作条件更易操纵；而固定化细胞不需要酶的提取，减少了酶活力的损失和操作，还能够利用细胞中的多酶体系，完成需要多种酶参加的反映。
另外固定的细胞能够是死的，也能够是活的。活的细胞在生产进程中可同时增殖，更有利于重复利用和加速反映速度，许多固定化的微生物活细胞，用来处置某些污水的工艺，一直运转几年，固定化细胞仍可利用。二、固定化的类型
用不同的载体和不同的操作方式将酶或微生物细胞固定，依照固定化的要紧机理，一样分成五类。
①吸附固定化 依照正、负电荷相吸的原理，酶或细胞吸附在载体的表面而被固定(图5-1a)。例如，用瓷碎片、玻璃球、尼龙网、棉花、木屑、毛发等做载体，经必然操作处置后，将酶或细胞吸附固定在其表面。
②包埋固定化 大分子的有机或无机聚合物，将酶或细胞包裹、载留在凝胶中而被固定(图5-1b)。例如：可用琼脂、明胶、海藻酸钙、k-角叉菜聚糖、聚丙烯酰胺等做载体，经必然的操作处置后，将酶或细胞包埋在里面。
③共价固定化 酶或细胞与载体通过共价键而被固定(图5-1c)。例如 ：酶或细胞溶液与含羧酸载体(R-COOH)或氨基载体(R-NH2)，在缩合剂碳化二亚胺作用下，经搅拌等处置，而制成固定化酶或细胞。
④交联固定化 采纳酶分子或细胞上的化合物基团之间在双功能基团交联剂作用下，与载体上的化合基团彼此交联呈网状结构而被固定(图5-1d)，最经常使用的交联剂是戊二醛。
⑤微囊固定化 用一层亲水性的半透膜将酶或细胞固定在珠状的微囊里(图5-1e)。例如：用海藻酸钠溶液与酶或细胞混合，滴入CaCl2溶液中形成凝胶微珠，然后用聚赖氨酸溶液处置微珠表面，再用柠檬酸去除海藻钙微珠的钙离子，使微珠内海藻酸成液态，酶或细胞悬浮其中，而微珠表面由于受到聚赖氨酸的处置，钙不被去掉，从而再也不溶解，形成一层微囊膜，酶或细胞包在微囊中而被固定。
图5-1 固定化类型的原理示意图 有的固定化酶（细胞）的制作机理既有吸附原理，也有包埋作用或化合键的形成，依照多种原理制成的固定化酶（细胞）其附着力更强，催化效率更好。 三、固定化酶应用存在的问题
固定化技术在微生物工业方面的应用，经以往20连年的研究开发，其优势愈来愈强，应用面愈来愈广。固定化酶由于研究开发较早，而且较易操纵，比固定化细胞的应用更为普遍和深切。现实中固定化细胞应用于工业化生产与咱们的期望还有距离，因此还需要不断拓宽应用范围和改良固定化技术。
存在的要紧问题有：
(1)对好氧反映的阻碍。 好氧反映需要充沛的氧气，固定化后的细胞壁和细胞膜，造成了底物或产物进、出的障碍和通气困难，往往严峻阻碍反映速度，致使产量低下。
(2)细胞（酶）与载体的稳固问题。有的固定化细胞容易自溶或污染，或固定化颗粒机械强度差，或细胞（酶）容易从载体脱落，或细胞（酶）的活性专门快被抑制，使反复利用次数少，产品质量和数量不稳固。
(3)基础条件问题。固定化酶（细胞）反映动力学及其有关机理、专用设备研究缺乏，也阻碍了该技术的应用。
随着深切的研究开发，专门是分子生物学技术手腕的增强，新材料的采纳，先进化工工艺的借鉴，运算机的利用，上述问题将会很快解决，微生物工业将发生庞大的变革。我国利用固定化细胞发酵生产酒精和啤酒已取得了专门好的经济效益，使咱们对固定化细胞的大规模应用充满信心。
本节课外阅读链接 固定化酶与咱们的日常生活
酶与咱们的日常生活息息相关，咱们所熟知的加酶洗衣粉中的酶是固定化酶仍是游离酶呢？通过前面章节的学习，咱们明白固定化酶的制作方式包括包埋法、吸附法和交联法等，而且，固定化酶可重复利用。因此显而易见，加酶洗衣粉当中的酶属于游离酶。那么固定化酶在咱们的日常生活中有哪些方面的应用呢？下面要紧通过固定化酶在食物工业中的应用来介绍固定化酶与咱们日常生活的关系。
1.固定化葡萄糖异构酶在高果糖浆生产中的应用
固定化葡萄糖异构酶是世界上生产规模最大的一种固定化酶，1973年就已应用在工业化生产，它能够用来催化玉米糖浆和淀粉生产高甜度的高果糖糖浆。用淀粉生产高果糖浆包括三步：（1）用淀粉酶液化淀粉；（2）用糖化酶将其转化为葡萄糖，即糖化；（3）用葡萄糖异构酶将葡萄糖异构为果糖。由此可取得含果糖55%的高果糖浆，当与蔗糖一样甜度时，其价钱要低10%~20%，因此具有经济推动力。高果糖浆用于替代蔗糖，目前世界上的产量约9000kt。固定化葡萄糖异构酶是固定化酶应用得很成功的工业实例，尔后几十年中它将是应用最广，市场份额最大的固定化酶。
2.固定化酶在柑桔汁加工中的应用
柑桔加工产品显现过度苦味是柑桔加工业中较棘手的问题，苦味物质要紧由2类物质组成：一类为柠檬苦素的二萜烯二内酯化合物（A和D环）；另一类为果实中多种黄酮苷，其中柚皮苷为葡萄柚和苦橙等柑桔类果汁中要紧的黄酮苷。能够利用不同的固定化酶别离作用于柠檬苦素和柚皮苷，使之转化为不含苦味的物质，从而达到解决柑桔加工产品过度苦味问题的目的。
3.固定化酶在啤酒澄清中的应用
啤酒以其清楚度高、泡沫适中、营养丰硕和口感好取得人们的偏爱。可是，由于啤酒中含有必然量的蛋白质，它会与游离于啤酒中的多酚、单宁等结合产生不溶性胶体或沉淀，造成啤酒混浊，严峻阻碍啤酒的质量。温燕梅等采纳吸附—交联法，使胰蛋白酶先吸附于磁性胶体粒子表面，后用戊二醛双功能试剂交联，形成“酶网”裹着载体形成固定化酶，该磁性酶对澄清啤酒避免冷浑浊有明显成效。赵炳超等在戊二醛做交联剂的条件下，以介孔分子筛MCM248作载体固定化木瓜蛋白酶，所得固定化酶的热稳固性有了显著提高，固定化酶的pH 值稳固性和储藏稳固性也有了明显改善。
4.固定化酶用于水解牛奶中的乳
牛奶中含有%~%的乳糖。患乳糖酶缺乏症的人饮用牛奶后可能显现呕吐、腹泻、烦躁不安等病症。用乳糖酶能够将乳糖分解为组成乳糖的两个单糖：半乳糖和葡萄糖。用固定化乳糖酶反映器能够持续处置牛奶，将乳糖分解，用于持续化生产低乳糖奶，该技术已于1977年实现工业化。另外，乳糖在温度较低时易结晶，用固定化乳糖酶处置后，能够避免其在冰淇淋类产品中结晶，改善口感，增加甜度。固定化乳糖酶还能够用来分解乳糖，制造具有葡萄糖和半乳糖甜味的糖浆。
5.固定化酶在食物检测和传感器中的应用
食物中的农药残留分析愈来愈受到人们的关注，蔬菜中有机磷农药残留的快速检测已成为目前人们研究的热点。应用有机磷农药对胆碱酯酶特异性抑制的酶化学比色分析法已被普遍应用于有机磷农药的定性、定量检测。
5.固定化酶在传感器中的应用
生物传感器被以为是一种由受体、抗体或酶组成的生物感应层于换能器紧密连接而能提供环境组成信息的感应器。如：测量电流和电位的酶电极，酶热敏电阻装置，以场效应管为基础的生物传感器，和生物发光及化学发光为基础的纤
维—光学传感器等，不同的传感器都应用不同类型的固定化酶。 四、固定化技术在食物工业中应用的前景和进展
随着生物技术的迅速进展，固定化酶在工业中的应用日趋普遍，从以上黎自能够看出，固定化酶在食物生产中起着举足轻重的作用。除以上几种典型应用外，固定化酶还可应用于食物中农药残留的检测，和作为生物传感器的重要部件，与信息科学结合，更高效地效劳于咱们的生活，生物传感器将在下一章节详细介绍。随着生物技术和材料、化工、信息技术等各相关学科的进展，咱们能够通过进展酶的定向固定化技术、探讨新型载体、成立多酶固定化系统和开发新型、高效固定化酶反映器等反方式来增加了酶的稳固性，提高酶的利用效率，更好地为咱们的生产、生活效劳。
第六节 生物传感器
从上世纪60年代Clark和Lyon提诞生物传感器的假想开始，生物传感器的进展距今已有40连年的历史了。作为一门在生命科学和信息科学之间进展起来的交叉学科，生物传感器在发酵工艺、环境监测、食物工程、临床医学、军事及军事医学等方面取得了重度重视和进展。随着社会信息化进程的进一步加速，生物传感器必将取得愈来愈普遍的应用。 一、生物传感器的概念
生物传感器是利用固定化的生物分子结合换能器，用于侦测生物体内或生物体外的环境化学物质或与之起特异性交互作用后产生响应的一种装置。生物最大体特点之一确实是能够对外界的各类刺激作出反映。第一是由于生物体能感受外界的各类刺激信号，并将这些信号转换成体内信息系统所能接收并处置的信号。例如，人能通过眼、耳、鼻、舌、身等感觉器官将外界的光、声、温度及其它各类化学和物理信号转换成人体内神经信息系统能够接收和处置的信号并采取应付方法。现代和以后的信息社会中，信息处置系统要对自然和社会的各类转变作出反映，第一需要通过传感器对外界各类信息的感应并转换成信息系统中的信息处置单元（即运算机）能够接收和处置的信号。
生物传感器的诞生是酶技术与信息技术结合的产物。 二、生物传感器的结构与分类
生物传感器由两个要紧关键部份组成。一部份是生物传感器信号接收或产生部份，来自于生物体分子、组织部份或个体细胞的分子识别组件；另一部份为属于硬件仪器组件部份，要紧为物理信号转换组件。
能够依照感受器中所采纳的生命物质不同将生物传感器分为组织传感器、细胞传感器、酶传感器等等，也可依照所监测的物理量、化学量或生物量将其命名为热传感器、光传感器、胰岛素传感器等，还可依照其用途统称为免疫传感器、药物传感器等等（如图5-2）。
、 图5-2 生物转感器的种类 三、生物传感器的进展历史
第一代生物传感器：1962年Clark和Lyon两人第一报导了用葡萄糖氧化酶与氧电极相结合监测葡萄糖的结果，1967年Updike和Hicks将葡萄糖氧化酶固定在氧电极表面，成功研制出酶电极，被以为是世界上第一个生物传感器。但这种传感器抗干扰能力差，背景电流打，易受溶液中氧浓度转变的阻碍。1977年铃木周一等发表了关于对生化需氧量（BOD）进行快速测定的微生物传感器的报导，并在微生物传感器对发酵进程的操纵等方面作了详细的报导，正式提出了对生物传感器的命名。1979年，第一代生物传感器投入医检市场，为美国YSI公司（维赛仪器公司）生产的血糖测试用酵素电极。YSI公司的成功上市与80年代电子信息业的蓬勃进展有很紧密的关系，而且一举带动了生物传感器的研发烧潮。美国Medisense公司（1995年被雅培公司收购）继续以研发第一代酵素电极为主，1988年公司成功地开发出便携式的电化学血糖仪-Exactechpen，在第一代生物传感器产品中占有70%以上的市场分额。目前全世界天天仍有250万人利用Medisense的血糖仪。
第二代生物传感器：为克服第一代生物传感器受氧分压阻碍和H2O2过电位高、干扰多、受氧溶解度限制等，自80年代起人们开始用小分子的电子传递媒
介体来代替氧沟通酶的活性中心与电极之间的电子通道，通过检测媒介体的电流转变来反映底物浓度的转变，构造了第二代生物传感器——媒介型生物传感器。第二代的生物传感器代表是1991年上市的瑞典Pharmacia公司推出的BIAcore与BIAlite两项产品。
第三代生物传感器：尽管媒介体型第二代生物传感器有许多优势，人们仍在追求酶与电极间的直接电子转移，因为基于这种原理制备的传感器与氧或其它电子受体无关，无需引入外加媒介体，因此固定化相对简单，无外加毒性物质，是最理想的生物传感器，人们将这种无需外加媒介体的生物传感器称为第三代生物传感器。第三代的生物传感器定位在更具携带式、自动化与实时测定功能。迄今为止，报导较多的主若是过氧化物酶传感器。 四、生物传感器要紧应用领域 1．应用于发酵工业
因为发酵进程中常存在酶的干扰物质，而且发酵液往往不是清澈透明的，不适用于光谱等方式测定。而应用微生物传感器那么极有可能排除干扰，而且不受发酵液混浊程度的限制。同时，由于发酵工业是大规模的生产，微生物传感器本钱低、设备简单的特点、能够排除干扰使其具有极大的优势，因此微生物传感器在发酵工业中取得了普遍的应用。具体表此刻以下几个方面：
(1)原材料及代谢产物的测定 微生物传感器可用于原材料如糖蜜、乙酸等的测定，代谢产物如头孢霉素、谷氨酸、甲酸、甲烷、醇类、青霉素、乳酸等的测定。测量的原理大体上都是用适合的微生物电极与氧电极组成，利用微生物的同化作用耗氧，通过测量氧电极电流的转变量来测量氧气的减少量，从而达到测量底物浓度的目的。
(2)微生物细胞总数的测定 在发酵操纵方面，一直需要直接测定细胞数量的简单而持续的方式。人们发此刻阳极表面，细菌能够直接被氧化并产生电流。这种电化学系统已应用于细胞数量的测定，其结果与传统的菌斑计数法测细胞数是相同的。
(3)代谢实验的鉴定 传统的微生物代谢类型的鉴定都是依照微生物在某种培育基上的生长情形进行的。这些实验方式需要较长的培育时刻和专门的技术。微生物对底物的同化作用能够通过其呼吸活性进行测定。用氧电极能够直接测量微生物的呼吸活性。因此，能够用微生物传感器来测定微生物的代谢特点。那个系统已用于微生物的简单鉴定、微生物培育基的选择、微生物酶活性的测定、废水
处置的微生物选择、活性污泥的同化作用实验、生物降解物的确信、微生物的保留方式选择等。 2．应用于食物工业
（1）新鲜度与成熟度的检测 生物传感器能够用来检测食物中营养成份和有害成份的含量、食物的新鲜程度等。如已经开发出来的酶电极型生物传感器可用来分析白酒、苹果汁、果酱和蜂蜜中的葡萄糖含量，从而衡量水果的成熟度。 （2）食物添加剂分析 食物添加剂的种类很多，如甜味剂、酸味剂、抗氧化剂等。将生物传感器用于食物添加剂的分析较为快速准确。亚硫酸盐通常作为食物工业的漂白剂和防腐剂。采纳亚硫酸盐氧化酶为灵敏材料制成的电流型二氧化硫酶电极可用于测定食物中的亚硫酸含量。
（3）农药残留、重金属分析 应用电化学生物传感器检测残留农药，如关于有机磷农药和氨基甲酸酯类农药，已经开发出一系列用于胆碱酯酶电化学生物传感器。在重金属分析中，选择适合的酶并将其固定在亲和性膜上，结合Clark氧电极，通过计算氧的消耗量就能够够推知重金属的污染程度。 3．应用于医学领域
生物传感器在医学领域也发挥着愈来愈大的作用：临床上用免疫传感器等生物传感器来检测体液中的各类化学成份，为医生的诊断提供依据；在军事医学中，对生物毒素的及时快速检测是防御生物武器的有效方法。生物传感器已应用于监测多种细菌、病毒及其毒素。生物传感器还能够用来测量乙酸、乳酸、乳糖、尿酸、尿素、抗生素、谷氨酸等各类氨基酸，和各类致癌和致突变物质。 4．应用于环境监测
环保问题已经引发了全世界性的普遍关注，用于环境监测的专业仪器市场也愈来愈大，如生化需氧量（BOD值）的测定、各类污染物（经常使用的重要污染指标有氨、亚硝酸盐、硫化物、磷酸盐、致癌物质与致变物质、重金属离子、酚类化合物）浓度的测定等都已经成功采纳了生物传感器进行检测。
本节课外阅读链接 以后的生物传感器是如何的？
最近几年来，随着生物科学、信息科学和材料科学进展功效的推动，生物传感器技术的进展突飞猛进。可是，目前生物传感器的普遍应用仍面临着许多困难，尔后一段时刻里，生物传感器的研究工作将要紧围绕选择活性强、选择性高的生物传感原件；提高信号检测器的利用寿命；提高信号转化器的利用寿命；生物响应的稳固性和生物传感器的微型化、便携式等问题。能够预见，以后的生物传感器将具有以下特点：
1.功能加倍全面，朝微型化方向进展
以后的生物传感器将进一步涉及医疗保健、食物检测、环境监测、发酵工业的各个领域。当前生物传感器研究中的重要内容之一确实是研究能代替生物视觉、听觉和触觉等感觉器官的生物传感器,即仿生传感器。已报导有植入体内的微小传感器实时监测血糖转变或通过脑电波监测预知癫痫的发作。而且随着微加工技术、纳米技术和芯片技术的进步，生物传感器将不断地朝着微型化方向进展，各类便携式微型生物传感器将不断地出此刻人们眼前。 2.智能化和集成化程度更高
以后的生物传感器将会和运算机完美紧密的结合，能够自动搜集数据、处置数据，能够更科学、更准确地提供检测结果，实现采样、进样、最终形成检测的自动化系统。同时, 芯片技术将愈来愈多地进入传感器领域,实现检测系统的集成化、一体化。 3.充当密码作用
日前，美国加州大学伯克利分校的科学家正试图通过生物识别传感器来替代传统的密码，他们成功打造出了一款类似于传统耳机的脑电图扫描仪，在进行登岸操作的时候将会依照用户的脑电波进行身份验证从而保证唯一性。
生物识别传感器,这项技术似乎听着加倍玄乎,可是却已经出此刻很多电话当中，例如支持指纹识别的电话已经层出不穷，iPhone 5S和东芝G500等都已经采纳了这项技术。为免去用户经历日趋增多的网络密码的苦恼，近日英特尔研究人员在平板电脑中集成一个生物识别传感器，能识别用户手掌上独特的纹理。让笔记本、平板电脑和智能电话负责识别用户身份，将使各个网站没有必要再次识别，幸免在各个网站输入密码。 4.联用技术
生物传感器将不断与其他分析技术联用，如流动注射技术、色谱等，相互扬长避短。
总之，以后的生物传感器技术将朝着微型化、智能化、低本钱、高寿命、高灵敏度、强稳固性的方向进展。另一方面，这些特性的改善也会加速生物传感器的市场化、商品化进程。相信在不久的以后，生物传感器必然会给人们的生活带来庞大的转变。
温习试探题：
1．名词说明：酶 酶工程 固定化酶（细胞） 酶活性中心 生物传感器 2．什么缘故酶的生产要紧来源于微生物？ 3．如何取得优良的产酶菌株？ 4．酶分离纯化的要紧技术方法有哪些？ 5．酶分子修饰的含义是什么？有何意义？
6．简述酶工程技术在食物工业、医药工业、环保行业等各领域的应用。 7．什么是生物传感器？其工作原理是什么？ 8．谈谈酶工程技术与生物技术各个学科之间的关系。
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