(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 111184682 A(43)申请公布日 2020.05.22
(21)申请号 202010254582.1(22)申请日 2020.04.02
(71)申请人 安赛搏（重庆）生物技术有限公司
地址 400700 重庆市北碚区蔡家岗镇凤栖
路8号(72)发明人 宋静静 陈萌 马原 王军 刘磊
张卫 (74)专利代理机构 天津市杰盈专利代理有限公
司 12207
代理人 朱红星(51)Int.Cl.
A61K 8/99(2017.01)A61K 8/9789(2017.01)A61Q 19/02(2006.01)A61Q 19/08(2006.01)
权利要求书1页 说明书8页 附图2页
(54)发明名称
一种具有美白抗氧化功效的海茴香细胞提取物的制备方法
(57)摘要
本发明公开了一种具有美白抗氧化功效的海茴香细胞提取物的制备方法，其特征在于：准确称取海茴香细胞，加入提取溶剂进行提取，之后进行离心或抽滤，收集上清液，即为海茴香细胞提物，然后对海茴香细胞提取物进行总黄酮、总酚酸和总酚的含量检测，进行美白、抗氧化功效测定。采用本发明制备的海茴香细胞提取物，由于含有丁二醇或丙二醇，具有良好的防腐和稳定性，不需要额外添加其它防腐剂或稳定剂；提取物具有良好的水溶性，区别于市场的油溶性产品。CN 111184682 ACN 111184682 A
权 利 要 求 书
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1.一种具有美白抗氧化功效的海茴香细胞提取物的制备方法，其特征在于：准确称取海茴香细胞，加入提取溶剂进行提取，之后进行离心或抽滤，收集上清液，即为海茴香细胞提取物，然后对海茴香细胞提取物进行总黄酮、总酚酸和总酚的含量检测，进行美白、抗氧化功效测定；所述提取溶剂指的是：在提取溶剂中，丁二醇或丙二醇的比例各自占比或总共占比为20-80%，占比指的是质量占比；所述的提取方法分别为3种：高温提取、浸提和超声提取； 所述的海茴香细胞包含：海茴香细胞的干燥细胞、鲜细胞和冻细胞。
2.权利要求1所述的提取物方法，其中海茴香细胞的提取方法中包括：高温提取方法：提取温度60-100℃，提取时间0.5-2h，海茴香干细胞料液比重量份数比为1:20-1:100，鲜细胞或冻细胞料液比重量份数比为1:2-1:5；超声提取方法：提取温度40-60℃，超声时间30-60min，海茴香干细胞料液比重量份数比为1:20-1:100，鲜细胞或冻细胞料液比重量份数比为1:2-1:5；浸提提取方法：常温浸提，提取时间4-24 h，海茴香干细胞料液比重量份数比为1:20-1:100，鲜细胞或冻细胞料液比重量份数比为1:2-1:5。
3.采用权利要求1所述具有美白抗氧化功效的海茴香细胞提取物制备方法制备的海茴香细胞提取物在用于具有美白、抗氧化功效的化妆品中的应用。
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说 明 书
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一种具有美白抗氧化功效的海茴香细胞提取物的制备方法
技术领域
[0001]本发明属于植物提取生物技术领域，涉及一种具有美白抗氧化功效的海茴香细胞提取物的制备方法。
背景技术
[0002]海茴香最早生长于纯净无污染的法国布列塔尼(Bretagne)海岸，布列塔尼半岛位于法国西部，犹如一只尖角伸入浩瀚的大西洋东部，大西洋带来的海风由这里开始登入欧洲大陆，进而形成了席卷整个欧洲的温带海洋性气候。不仅冬暖夏凉，由于海风和岸基岩质的共同作用形成了种类繁多的魔幻般的海岸地貌。布列塔尼的陆地和海岸，郁郁葱葱，充满各种神奇的、特别的植物，海茴香是其中之一。由于根部必须吸收海岸间的养分去面对严苛的陆地环境，进而发展出一种独特生命系统。海茴香的生长季节仅限于春季，一年的采收期约为四月至六月间，故海茴香也被法国人列为限制开采的国宝级植物，而手工摘取、生长不易限量采收的特性，被喻为21世纪最珍稀的保养成分。[0003]海茴香中含有挥发性萜烯类物质，因为具有特出香味，主要用于食品烹调领域。现有市场上，具有的海茴香提取物主要针对于其挥发性萜烯类物质进行的提取，对大部分菌有较低活性，仅对厌氧的产气荚膜梭菌的生长有良好的抑制作用，对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌的值均在250以上。
[0004]现有主要是以天然海茴香为本体进行产品开发，但是海茴香的生长具有区域限制，使其开发和使用具有局限性。本发明是以人工培养的海茴香植物细胞为本体，可以进行大规模的产业化生产，没有使用局限；同时，市场现有海茴香系列产品主要针对挥发性物质萜烯类进行的提取，产品表现为油溶性，其产品配伍性具有局限性，使海茴香细胞提取物的产品应用受到限制。本发明具有良好的水溶性，解决了与水剂产品不配伍的问题。发明内容
[0005]本发明对海茴香细胞中的有效成分进行提取，增加海茴香细胞提取物的适用范围，解决了使用受限以及配伍受限的问题，开发了具有美白抗氧化功能的海茴香细胞提取物。
[0006]本发明提取的海茴香细胞区别于市场上海茴香产品，本发明首先是以海茴香细胞作为本体进行的功效成分提取，其成分区别于天然培养的海茴香成分，第二，市场上的产品是以海茴香中的非极性成分作为其功效成分进行提取和开发产品的，本发明是以海茴香细胞中的水溶性成分和弱极性成分为功效成分进行提取和产品开发，第三，本发明的产品主要用于具有美白抗氧化的化妆品领域。[0007]为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
一种具有美白抗氧化功效的海茴香细胞提取物的制备方法，其特征在于：准确称取海茴香植物细胞，加入配制的多元溶剂进行提取，之后进行离心或抽滤，收集上清液，即为海茴香细胞提取物，然后对海茴香细胞提取物进行总黄酮、总酚酸和总酚的含
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量检测，进行美白和抗氧化功效测定；
所述提取溶剂指的是：在提取溶剂中，丁二醇或丙二醇的比例各自占比或总共占比为20-80%，占比指的是质量占比。 所述的提取方法分别为3种：高温提取、浸提和超声提取； 所述的海茴香细胞包含：海茴香细胞的干燥细胞、鲜细胞和冻细胞。[0008]本发明所述的提取物方法，其中海茴香细胞的提取方法中：
高温提取方法：提取温度60-100℃，提取时间0.5-2h，海茴香干细胞料液比重量份数比为1:20-1:100，鲜细胞或冻细胞料液比重量份数比为1:2-1:5；
超声提取方法：提取温度40-60℃，超声时间30-60min，海茴香干细胞料液比重量份数比为1:20-1:100，鲜细胞或冻细胞料液比重量份数比为1:2-1:5；
浸提提取方法：常温浸提，提取时间4-24h，海茴香干细胞料液比重量份数比为1:20-1:100，鲜细胞或冻细胞料液比重量份数比为1:2-1:5。
[0009]本发明进一步公开了具有美白抗氧化功效的海茴香细胞提取物制备方法制备的海茴香细胞提取物在用于具有美白、抗氧化功效的化妆品中的应用。实验结果显示海茴香细胞提取物具有美白、抗氧化和抗炎功效。
[0010]本发明主要解决了具有较好水溶性的海茴香细胞提取物的制备方法，重点考察了制备的海茴香细胞提取物的美白、抗氧化功效，主要的难点在于海茴香提取过程中提取溶剂的筛选，以及比例确定。
[0011]本发明更加详细的描述：
1，准确称取海茴香干燥植物细胞（干燥粉末）5g，以料液比1：40加入含有40%丁二醇水溶液200mL，沸腾提取1h，之后进行6500rpm离心10min，收集上清液，即为海茴香细胞提物液体。对海茴香细胞提取物进行总黄酮、总酚酸和总酚的含量检测，和抗氧化、美白功效测定。[0012]总黄酮检测方法：
1）绘制标准曲线：准确称取10mg芦丁对照品，甲醇溶解，定容100mL, 配制0.2mg/mL的芦丁对照品溶液。精密吸取芦丁对照品溶液1、2、3、4、5与6 mL，分别置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6分钟，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6分钟，加4%氢氧化钠试液10 mL，加纯水定容至25mL，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，照分光光度法，在500 nm的波长处测定吸收度。[0013]2）样品总黄酮含量测定：对海茴香细胞提取物采用如上方法进行总黄酮含量检测，计算总黄酮含量。[0014]总酚酸检测方法：
1）绘制标准曲线：准确称取绿原酸2.7mg，无水乙醇溶解，定容10mL，精密吸取对照品溶液40、80、120、160和200μL，置于1.5mL的EP管中，分别加水定容至1.0mL，
分别置于25 mL量瓶中，各加无水乙醇至5mL；加入0.3%十二烷基硫酸钠溶液2mL，摇匀，加入0.9%铁氰化钾，0.6%三氯化铁溶液混合液1mL，摇匀，暗处放置5分钟，加入0.1mol/L盐酸溶液至刻度线，摇匀，在暗处放置20min。以加入无水乙醇5mL体积的溶液为空白，在760nm的波长处测定吸收度，以吸收度与其对应的质量计算线性回归方程，Y=kx+b。[0015]2）样品总酚酸含量测定：对海茴香细胞提取物采用如上方法进行总酚酸含量检测，计算总酚酸含量。[0016]总酚检测方法：
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1）绘制标准曲线：准确称取没食子酸10mg，定容至100mL，精密吸取对照品溶液40、80、120、160和200 μL，加水补足至1.2mL，加入50μLμL福林酚试剂，混匀，室温放置7分钟，加入290μL新鲜配置的20%Na2CO3溶液，涡旋混匀，放置1小时，在760nm的波长处测定吸收度，以吸收度与其对应的质量计算线性回归方程，Y=kx+b。[0017]2）样品总酚含量测定：对海茴香细胞提取物采用如上方法进行总酚含量检测，计算总酚含量。
[0018]对海茴香细胞提取物按照如上方法，分别进行总黄酮、总酚酸和总酚的含量检测，其结果如下表1所示：
表1海茴香细胞中总黄酮、总酚酸和总酚含量
抗氧化活性检测1）DPPH活性测定
DPPH乙醇溶液的配制：准确称取3 .94mg DPPH，加入无水乙醇溶解并定容至 100mL容量瓶中，配制成0 .1mM的DPPH溶液，低温(0-4℃)避光保存。量取不同体积的海茴香植物细胞提取物水溶液加入到3mL DPPH溶液中，混合均匀，之后加水补足至4mL，517nm下测其吸光度，计算其清除率，计算公式如下：
其中A对照为不加样品溶液，只加入1 .0mL纯化水的吸光度；A样品为不同体积样品溶液的吸光度。
[0019]实验结果如表2所示，实验结果表明海茴香植物细胞培养物提取液对DPPH自由基具有较强的清除能力。[0020]表2. 海茴香植物细胞培养物提取液对DPPH自由基的清除率
2)ABTS实验
所需溶液配制: 实施例5中100℃获得的海茴香植物细胞培养物提取液稀释5倍后，进行体外抗氧化实验。
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7.4mM ABTS溶液：准确称取0 .0384g ABTS置于10mL棕色容量瓶中，纯化水定容；2.6mM过硫酸钾溶液：准确称取0 .0066g过硫酸钾置于10mL容量瓶中，纯化水定容；ABTS工作液：7.4mM ABTS溶液与2.6mM过硫酸钾溶液以体积比1:1混合，室温条件下避光静置12h备用，使用前用80％乙醇溶液稀释至吸光度为0 .7±0 .02。[0022]样品对ABTS氧自由基的清除实验，准确量取不同体积的海茴香植物细胞培养物提取液样品液，加入到3 .4mL的ABTS工作液中，之后加水定容至4 .0mL , 混合均匀，室温静置30min，之后在734nm下进行分光光度检测，通过吸光度变化计算其清除率，计算公式如下：
其中A对照为不加样品溶液，只加入1 .0mL纯化水的吸光度；A样品为不同体积样品溶液的吸光度。
[0023]实验结果如表3所示，结果表明海茴香植物细胞培养物提取液对ABTS自由基具有很好的清除率
表3 海茴香细胞提取物对ABTS自由基的清除率实验
美白功效检测1）酪氨酸酶实验
准确称取酪氨酸酶粉末（1380u/mg，Sigma）0.00362g，用pH6.8 PBS磷酸缓冲溶液定容至50mL， 根据需求配制不同浓度梯度样品待测液，按照表4添加样品检测液，之后放置37℃水浴锅中恒温10min；然后在A、C管中依次加入酪氨酸酶，每次加酶间隔30 s，加酶后应立即涡旋15 s混匀，反应15 min。反应管恢复到室温后，紫外分光光度仪在475nm处测吸光值。[0024]实验结果如图1所示，表明海茴香细胞提取物具有抑制酪氨酸酶的效果，因此具有美白的功效。[0025]表4 酪氨酸检测添加试剂表
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样品对酪氨酸酶的活性抑制率（%）：
式中：A—空白样板有酶体系吸光值；B—空白样板无酶体系吸光值；C—样品组有酶体系吸光值；D—样品组无酶体系吸光值
海茴香植物细胞培养物提物液人体抗氧化和美白功效：将海茴香植物细胞培养物提物液以5%添加量添加至空白膏霜基质中，同时空白基质做对照，样品和空白基质配方如下表5，然后将制备好的霜给10名35-45的志愿者女性使用，使用42天后进行使用效果评价反馈。结果如表5所示。[0026]表5 空白基质霜和试验用海茴香细胞提取物霜的配方
表6 女性志愿者使用后效果反馈
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结论：除了在体外实验中海茴香细胞提取物表现出良好的美白、抗氧化效果，同时人体实验，更加确定了海茴香细胞提取物的美白、提亮和抗氧化的功效。
[0027]本发明公开的具有美白抗氧化功效的海茴香细胞提取物的制备方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：
（1）采用占有不同质量比的丁二醇或丙二醇的水溶液提取溶剂，制备的海茴香细胞提取物具有良好的水溶性，区别于市场的油溶性产品；
（2）采用本发明制备的海茴香细胞提取物，由于含有丁二醇或丙二醇，具有良好的防腐和稳定性，不需要额外添加其它防腐剂或稳定剂；
（3）采用本发明制备的海茴香细胞提取物，其提取溶剂为丁二醇、丙二醇和水，安全无刺激，同时丁二醇和丙二醇又是良好的保湿护肤原料。附图说明
[0028]图1样品对酪氨酸酶的抑制率；
图2海茴香细胞提取的工艺流程。
具体实施方式
[0029]下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。[0030]实施例1
具有美白抗氧化功效的海茴香细胞提取物的制备方法：准确称取海茴香干燥植物细胞干燥粉末5g，以料液比1：40加入含有40%丁二醇水溶液200mL, 超声提取1h，温度60℃，之后进行6500rpm离心10min，收集上清液，即为海茴香细胞提取物。
[0031]实施例2
准确称取10g的海茴香干细胞，以料液比1:60加入质量比分别为40%的丁二醇或丙二醇的水溶液以及纯水，沸腾提取1h，之后6500rpm离心10min，上清液进行黄酮、酚酸和总酚的含量检测，检测结果如下：
表7 海茴香细胞提取物中总黄酮、总酚酸和总酚含量
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实施例3
准确称取10g的海茴香干细胞，分别以料液比1:20,1:40, 1:60,1:80,1:100加入40%的丁二醇，常温浸提24h，之后6500rpm离心10min，上清液进行黄酮、酚酸和总酚的含量检测，检测结果如下：
表8 海茴香细胞提取物中总黄酮、总酚酸和总酚含量
实施例4
准确称取10g的海茴香干细胞，以料液比1:80加入60%的丙二醇水溶液，40℃下，分别超声提取15min、30min、45min和60min，之后6500rpm离心10min，上清液进行黄酮、酚酸和总酚的含量检测，检测结果如下：
表9 海茴香细胞提取物中总黄酮、总酚酸和总酚含量
实施例5
准确称取50g的海茴香鲜细胞和冻存细胞，以料液比1:2加入40%的丁二醇的水溶液，50℃下超声提取30min，之后6500rpm离心10min，上清液进行黄酮、酚酸和总酚的含量检测，检测结果如下：
表10 海茴香细胞提取物中总黄酮、总酚酸和总酚含量
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实施例6
准确称取50g的海茴香鲜细胞和冻存细胞，以料液比1:2加入40%的丁二醇的水溶液，常温下浸提12h，之后6500rpm离心10min，上清液进行黄酮、酚酸和总酚的含量检测，检测结果如下：
表11 海茴香细胞提取物中总黄酮、总酚酸和总酚含量
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