1、色谱柱的使用说明：
（1）色谱柱使用前注意事项：
色谱柱的储存液无特殊说明，均为评价报告所示的流动相。在使用前，一定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。在反相色谱中，如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂，应先用10％左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下，否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出，堵塞色谱柱。
（2）流动相：
流动相中所使用的各种有机溶剂要尽可能使用色谱纯，配流动相的水最好是超纯水或全玻璃器皿的双蒸水。如果将所配得流动相再经过0.45μm的滤膜过滤一次则更好，尤其是含盐的流动相。另外，装流动相的容器和色谱系统中的在线过滤器等装置应该定期清洗或更换。
以常规硅胶为基质的键合相填料通常的PH值适用范围是2.0-8.0，BDS C18适合于碱性化合物，PH值适用范围为2.0-10.0。当必须要在PH值适用范围的边界条件下使用色谱柱时，每次使用结束后立即用适合于色谱柱储存并与所使用的流动相互溶的溶剂清洗，并完全置换掉原来所使用的流动相。
（3）样品：
样品也要尽可能清洁，可选用样品过滤器或样品预处理柱（SPE）对样品进行预处理；若样品不便处理，要使用保护柱。在用正相色谱法分析样品时，所有的溶剂和样品应严格脱水。
2、色谱柱的保存??
（1）反相色谱柱每天实验后的保养：
使用缓冲液或含盐的流动相，实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。
（2）长期保存色谱柱：
如色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水（含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞）中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度最好是室温。
3、色谱柱的再生??
因为色谱柱是消耗品，随着使用时间或进样次数的增加，会出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰的现象，一般来说可能是柱效下降。
（1）反相柱的再生：依次采用20-30倍的色谱柱体积的甲醇：水=10：90 （V/V），乙腈，
异丙醇作为流动相冲洗色谱柱，完成后再以相反顺序冲洗色谱柱。
（2）正相柱的再生：依次以20-30倍色谱柱的体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗色谱柱，然后再以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意上述溶剂必须严格脱水。
4、色谱柱在使用过程中易出现的问题和解决办法??
色谱柱在使用中最常见的问题就是柱压升高，如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加，属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高（系统管路堵塞及压力传感器故障除外），可能的原因有如下几点：
（1）色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染；
（2）色谱柱头的填料被样品污染；
（3）色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出；
（4）流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。
解决办法如下：
（1）如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在10％的稀硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。
（2）如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。
（3）如确定定是盐结晶，用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。
（4）如果因PH值使用不当，很难恢复。液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。正相柱大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合-CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱；反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。另外还有离子交换柱，GPC柱，聚合物填料柱等。本文重点介绍反相色谱柱的选择和使用： 一、反相色谱柱的选择 1．柱子的PH值使用范围
? ???反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。但硅胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的PH范围。一般的C18柱PH值范围都在2-8，流动相的PH值小于2时，会导致键合相的水解；当PH值大于7时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。如果流动相PH较高或经常使用缓冲液时，建议选择PH范围大的柱子，例如戴安公司的Acclaim柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11. 5的柱子。 2．填料的端基封尾（或称封口）
? ???把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。 1、进样量
柱子的最大载样量取决于：柱子的型号，使用的条件和样品的类型，很难给出一个一般的指示。对于进样体积的建议则比较容易（见表中的典型值）。注射了太大体积或太浓的样品会使色谱柱过载，导致峰展宽，变形或者峰融合。
2、流量和压力
注意最高压力：不锈钢柱<4500psi；玻璃柱<3000psi
增加流速或者降低流速要采取小的间隔变化以防止填充床的扰动。
如果你想更换柱子，，要降低流量至0，等待洗脱液完全流出柱子为止（2分钟）。 拆除柱子而没有等待压力的降低会损坏柱子。 高柱压的产生一般是由于不正确地使用柱子的结果。
使用保护柱会防止污染物沉积在分析柱上。HPLC使用注意事项
1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜 过滤)。??
2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。 3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。
4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然 后用甲醇(或甲醇水溶液)冲 洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆 外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。
5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。
6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。 7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。
8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查 并清洗。清洗方法；①以异 丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清 洗；⑧用10％稀硝酸清洗。
9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。
10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相 的清洗。 11.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的 流动相中。
更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。
高效液相色谱常见故障的断定及解决诊状 可能的原因 解 决 方 法?? ??(一)保留时间变化??
? ? 1.柱温变化 柱恒温，必要时需配置恒温箱
? ? 2.等度与梯度间未能充分平衡 至少用10倍柱体积的流动相平衡柱 ? ? 3.缓冲液容量不够 用》25mmol/L的缓冲液 ? ? 4.柱污染 每天冲洗柱
? ? 5.柱内条件变化 稳定进样条件,调节流动相 ? ? 6.柱快达到寿命 采用保护柱 ??(二)保留时间缩短??
? ? 1.流速增加 检查泵,重新设定流速 ? ? 2.样品超载 降低样品量
? ? 3.键合相流失 流动相PH值保持在3\"7.5检查柱的方向 ? ? 4.流动相组成变化 防止流动相蒸发或沉淀 ? ? 5.温度增加 柱恒温 ??(三)保留时间延长??
? ? 1.流速下降 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡
? ? 2.硅胶柱上活性点变化 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化 ? ? 3.键合相流失 同前(二)3 ? ? 4.流动相组成变化 同前(二)4 5.温度降低 同前(二)5 ??(四) 出现肩峰或分*??
? ? 1.样品体积过大 用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15% ? ? 2.样品溶剂过强 采用较弱的样品溶剂
? ? 3.柱塌陷或形成短路通道 更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件 ? ? 4.柱内烧结不锈钢失效 更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品 ? ? 5.进样器损坏 更换进样器转子 ??(五)鬼峰
? ? 1.进样阀残余峰 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗 ? ? 2.样品中未知物 处理样品
? ? 3.柱未平衡 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱) ? ? 4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) 每天新配,用抗氧化剂
? ? 5.水污染(反相) 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水 ??(六) 基线噪声??
? ? 1.气泡(尖锐峰) 流动相脱气,加柱后背压
? ? 2.污染(随机噪声) 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂 ? ? 3.检测器灯连续噪声 更换氘灯
? ? 4.电干扰(偶然噪声) 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等) ? ? 5.检测器中有气泡 流动相脱气,加柱后背压 ??(七)峰拖尾??
? ? 1.柱超载 降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相 ? ? 2.峰干扰 清洁样品,调整流动相
? ? 3.硅羟基作用 加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品
? ? 4.同前(四)4 同前(四)4 ? ? 5.同前(四)3 5.同前(四)3
? ? 6.死体积或柱外体积过大 连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管
? ? 7.柱效下降 用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱 ??(八)峰展宽??
? ? 1.进样体积过大 同(四)1
? ? 2.在进样阀中造成峰扩展 进样前后排出气泡以降低扩散 ? ? 3.数据系统采样速率太慢 设定速率应是每峰大于10点
? ? 4.检测器时间常数过大 设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10% ? ? 5.流动相粘度过高 增加柱温,采用低粘度流动相 ? ? 6.检测池体积过大 用小体积池,卸下热交换器
? ? 7.保留时间过长 等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱 ? ? 8.柱外体积过大 将连接管径和连接管长度降至最小 ? ? 9.样品过载 进小浓度小体积样品液相色谱柱使用经验谈
色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最 佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。?? 1、样品的前处理：??
??a、最好使用流动相溶解样品。??
??b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。?? ??c、使用0.45祄的过滤膜过滤除去微粒杂质。??
2、流动相的配制： 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流??
动相具备以下的特点：??
a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。??
b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。??
c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。??
d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。??
e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。??
f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
2、流动相流速的选择： 因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。 当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如
使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。?? 注意：??
a．由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。??
b．对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水最好使用超纯水(电阻率大于18兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。??
c．含水流动相最*在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。??
d．流动相要求使用0.45 祄滤膜过滤，除去微粒杂质。??
e．使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能
HPLC的常用术语 第一部分 色谱曲线??
1、? ? romatogram）：色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间或流动相流出体积的曲线图，或者通色谱图（ch过适当的方法观察到的纸色谱或薄层色谱斑点、谱带的分布图。
2、? ? （色谱）峰（chromatographic peak）：色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线。 此主题相关图片如下： 此主题相关图片如下： 3、峰底（peak base）：峰的起点与终点之间的连接的直线（图1 中的CD）。 4、峰高（h ，peak height）：色谱峰最大值点到峰底的距离（图1 中的BE）。 5、峰宽（W ，peak width）：在峰两侧拐点（图1 中的F ，G）处所作切线与峰底相交两点的距离（图? ? 1 中的KL）。
6、半高峰宽（W h/2 ，peak withd at half height）：通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直 线??与峰两侧相交两点之间的距离（图1 中的HJ）。
7、峰面积（A ，peak area）：峰与峰底之间的面积（图1中的CHEJDC）。 8、拖尾峰（tailing peak）：后沿较前沿平缓的不对称的峰。
9、前伸峰（leading peak）：前沿较后沿平缓的不对称的峰。（又叫伸舌峰、前延峰） 10、假峰（ghost peak）：除组分正常产生的色谱峰外，由于仪器条件的变化等原因而在谱图上出现的色谱峰，即并非由试样所产生的峰。这种色谱峰并不代表具体某一组分，容易给定性、定量带来误差。（又叫鬼峰）
11、畸峰（distrorted peak）：形状不对称的色谱峰， 前伸峰、拖尾峰都属于这类。?? 12、反峰（negative peak）：也称倒峰、负峰，即出峰的方向与通常的方向相反的色谱峰。
柱的使用和维护注意事项(推荐)
色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。
① 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）。
2.应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然
③ 一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头
的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。
④ 选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，? ? 分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶\"饱和\"，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。
⑥ 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50\"75ml。
下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：硅胶柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使硅胶表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略最后用水冲洗这一步。一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质，在甲醇（乙腈）冲洗时重复注射100\"200祃四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脱能除去蛋白质污染。阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗，除去交换性能强的盐，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有机物）、甲醇、水依次冲洗。
⑦ 保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。
⑧ 色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出1\"2mm高度（注意把被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相（与柱内相同）填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析 柱相同固定相的短柱（5\"30mm），可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的。 通常色谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，只能在pH2\"9范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，特别是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷，使柱效下降，这时也可补加填料使柱效恢复。每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素（氟、氯、溴）的化合物可能会腐蚀不锈钢管道，不宜长期与之接触。装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔4\"5天开机冲洗15分钟。
本质上是填料(固定相)的不同,正相色谱柱填料极性强,洗脱顺序由弱到强；反相色谱柱填料极性弱，洗脱顺序由强到弱。以下是详细说明：
1、正相色谱 正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica）以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2，APS）和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。
由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷（Hexane），氯仿（Chloroform），二氯甲烷（Methylene Chloride）等。
2、反向色谱 反向色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。
常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等
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