染色体终端和端粒酶(翻译)

母到人类癌症及老化的通路

Elizabeth H Blackburn, Carol W Greider & Jack W Szostak

端粒问题

科学发现都是个体独立的，并且通过自己独特的方式发生。然而，其中是包括某些关键成分为他们成功设立台阶的。在端粒酶的发现中这些成分的许多有着重要的作用：和不同领域的科学家交流、注意到不同寻常的发现和勇于冒险做疯狂的实验。我们将阐述这些成分的联合和有成效的合作是如何引领我们假定和发现端粒酶的存在的。

最早的对端粒功能性的描述要追朔到基因学家Hermann Muller 用X射线来粉碎染色体。几乎同一时间对果蝇进行研究的Muller和对玉米进行研究的Barbara McClintock得出了同样的结论：染色体的自然末端是有别于那些被创造的染色体片段的同一末端的。自然末端被以某种方式从发生在断裂末端频繁重排中保护起来不受影响。正如McClintock 在1931年的一篇关于频繁的末端联合的研究报告写到，‚那种一个染色体片段连接到另一个染色体（完整的染色体）末端的例子没有被发现。‛在1938年，Muller命名染色体自然末端为端粒。但是无论Muller还是McClintock都没有工具来研究这些染色体末端的分子本质。

染色体末端的分子本质问题只是在DNA结构被陈述时变得更有意义而已。直到60年代，Arthur Kornberg 发现了DNA聚合酶和它固定的机制。这个理解提出了另一个关于DNA末端的问题--------他们的完全复制是如何保证的?因为DNA聚合酶仅仅可以拓展一个被粗加工的引物，它不能复制特殊的线性DNA末端；这也就变成了著名的DNA末端复制问题。70年代初期，DNA噬菌体基因组的研究表明了DNA末端复制问题的答案在不同病毒之间是不同的。那么，真核生物的DNA末端是如何组织的呢？在1975年，刚在DNA测序被发明的剑桥的Fred Sanger小组完成研究生论文的Liz Blackburn 到了耶鲁大学Joe Gall的实验室完成博士后论文。Liz想应用在Sanger实验室学到的知识到理解端粒细胞本质中。 端粒走向分子：神秘的DNA终点

在探寻DNA染色体末端的一个最令人退却的方面是真核生物最大的染色体DNA长度。DNA克隆技术还没有被发明，所以为了能研究末端，缩短的染色体首先是必需的。在70年代 Joe Gall已经钻研了有些生物体为了rRNA产生多余的基因复制的进程。这种现象发生在如早期蛋白质合成需要快速生成的发育期。Joe已经发现编码rRNA的基因是在一个在青蛙发育卵母细胞高频出现的环状DNA分子上被扩充的。然后他发现同样的现象在一个非常不同的生物体----四膜虫也出现了，但这一次rDNA被扩充到线性DNA分子上了。四膜虫包括大量的几乎完全相同的相关的短的迷你染色体。这材料就成了Liz决定用来研究染色体的自然末端。

没有线路图来指导如何解决这个问题。但是Joe已经展示了当被从细胞中提取出来的时候分子的部分是环状的，一个敢于联想的lambda噬菌体的性质，线性DNA环状化后复制。因为Liz相信大自然会用一种优雅且通用的方式，所以她认为lambda的末端也许对四膜虫端点的分子本质是一个很好的模型。从而，她决定在试管内用已经成功的被Ray Wu和他的同事来测序lambda噬菌体家族基因组的DNA聚合酶的DNA修复反应。

这是个幸运的选择，因为rDNA的分子末端在允许DNA聚合酶来无困难地在试管中利用同位素三磷酸盐标记的端粒重复区带DNA是中断的。（这个的重要性至今很神奇）Liz然

后就能够通过联合一系列体外标记和分析技术来切分DNA序列的端粒，她想出了一个不是lambda系列的创举。rDNA的迷你染色体终端序列和这些分子的终端结构是复杂的并且不同于之前任何被描述过的。在四膜虫rDNA分子的每个末端在基础链有大约50个六核苷酸单元CCCCAA-TTGGGG串联重复----伴随着字母（G富足/连续）在线性DNA每个末端连接着3’OH末端。C连续的CCCCAA重复片段在至少一个重复阵列的部分单链化间断点。同样奇怪的是在纯化的群体中每个末端串联重复的数目是不均的，变幅从估计的最小数20到大约70.在1977年晚期，Liz在圣弗朗西斯科加利福利亚大学给Herbert Boyer 在生化部门的小组举行了一个描述rDNA末端的不同寻常的分子表象的演讲。演讲后的讨论中，Boyer实验室的一个小组成员问说是否在DNA总体的CCCCAA重复数目的不均会随着染色体末端的重复增生改变。Liz对这个问题可以知道感到颇有兴趣，但是在那时预见不到可以使其发生的明显方式。回过头看，这次对话是有先见之明的，正如后来Liz会发现一样，实际上这个增加是发生的。

新端粒被加到片段化的四膜虫染色体

在和Joe实验室的Meng-Chao Yao合作时，Liz展示了四膜虫中同样的端粒，不均的CCCCAA重复排布出现在体细胞核其他染色体DNA分子末端，但是这些序列没有在有着共同细胞核生成的生殖细胞系先驱DNA中出现。来自粘液菌绒泡菌和粘菌的线性rDNA迷你染色体端粒序列之后马上被确定了。当Liz在伯克利加利福利亚大学分子生物部门设臵了她的实验室，她继续着她在纤毛DNA端粒的研究。然后，她发现新的端粒序列通过不知道的机制被加到了线性rDNA迷你染色体末端。这些次染色体的大核DNA通过生殖细胞系的核染色体的发展性的调控DNA碎片生成。令人惊奇的是这里面没有不变的和末端连接的DNA序列。几乎在同一时间Dacid Prescott的小组在一不同的纤毛研究小组取得了相似的结果。于是问题变成了端粒重复如何增加的？（这边说的末端不变是否还是指重复数目不均，或者其它，不清楚）

在思考四膜虫端粒形成时，Liz在1982年写到‚……对大核DNA端粒来说是共同的序列一定在次级染色体断片形成时被获取。‛两种方式的路线可以被猜想到：端粒序列被调配或重新结合到发展中的大核DNA端粒上，或者简单、重复的端粒序列通过特定合成的机构被重新合成到端点。‛这个端粒重新添加的想法后来被进行的酵母实验所支持。 端粒功能跨越了界的领域

到1980年为止，我们了解了四膜虫的分子构造，但是构造和特别的端粒性质间的联系始终模糊。是否这种令人惊奇的构造是仅限于四膜虫和它有纤毛的亲属或者还是广泛保守的也还是未知之谜。从一个不太可能的在Liz .Jack 和近期在康奈尔刚完成和Ray Wu合作的研究生和博士后论文的Jack Szostak（也是在康奈尔学习完酵母的重新联合的）的合作出现后问题的答案逐渐浮现。在1979年Jack在波士顿的后来成为了悉尼癌症研究所的地方建立了他自己的实验室并且研究了发芽的啤酒酵母DNA末端高度引起重组的本质。同时，酵母转运的质粒载体都以环状DNA分子形态存在。更进一步，被限制酶消化的质粒线性结构导致DNA末端极度电性化：如果DNA末端和酵母细胞DNA同质的，那重新结合将导致质粒插入到染色体中；否则，DNA端粒会被分降解、结扎或者重排。Liz和Jack的合作开始于1980年在新汉普郡的一所学校（年度戈登核酸会议地址）的一次热烈的讨论。在听了Liz关于显著的四膜虫分子生物的描述后，Jack要Liz测试四膜虫的端粒是否在酵母中运作。这个想法如此有远见以至有些怪诞：测试端粒复制的机制是否保守在两个如此的进化疏远的物种间。 Liz和Jack推断说如果四膜虫端粒在转移到酵母细胞时保持它们的能力来巩固DNA末端，那么它们可以用来加盖于一个线性酵母质粒的末端，导致一个线性复制质粒有着固定的DNA末端。实验在操作技术上是简单的，预测结果----线性酵母质粒会被观测到而不是寻常的环状结构---将是不重要的来证实。两人提供的装配着一个纯化的四膜虫端粒DNA片段生

成了一些纳克级别的盖着四膜虫端粒的线性酵母质粒，并且引进了DNA到酵母细胞中。他获得了一打左右的用southern印记法分析的转化株。结果马上清楚了：超过半数的复制体以线性形态维持着引进的DNA。这个结果被更详细的DNA分析证实。这个结果表明端粒可以透过系统发生的界来行使功能，暗示了其显著的功能保守性。

酵母端粒揭示了端粒结构的保守性

这些线性的质粒为克隆酵母端粒提供了理想的载体。Jack移除了一个生成线性的、不能在酵母细胞维持存在的DNA碎片的四膜虫端粒。然后他通过加入随机酵母基因组片段到这个DNA线性片段来探索有功能的酵母端粒；仅当丢失的端粒被酵母端粒替代可以使DNA在酵母中以线性质粒存在。期望的线性质粒中三个被修复了，基因组酵母DNA的southern印记法展示线性质粒实际上携带者一个功能的酵母端粒。（FIG1）随着酵母端粒的可控制，研究有丝分裂和减数分裂间隔的真核染色体的端粒结构变得可能。

对初始线性质粒靠近的检查揭示了四膜虫端粒在它们酵母保持期变得更长在长度上更不均一。Janis Shampay在Liz的实验室测序了次克隆的酵母端粒和维持在酵母的四膜虫端粒发现酵母专一的TG1-3重复被加到了四膜虫TTGGGG重复。Liz在体外标记了酵母端粒，发现他们在C-富足的DNA链上也有单链化的间断点正如在四膜虫端粒看到的一样。Janice 然后发现酵母染色体的端粒也由一系列的 TG1-3重复终端组成。这些结果暗示了这些端粒在结构上和四膜虫原型端粒非常相似。端粒碎片的长度不均一反映了在质粒或染色体特殊末端DNA数目的变异性。这些结果让Jack和Liz提出了一种终端转移酶型的酶的存在性，这种酶可能增加重复单位到端部DNA作为一种为了不完全终端复制的侵蚀的补偿机制。

克隆的端粒碎片的实用性允许Jack实验

室的一个研究生Andrew Murray开始仿建第一个人工染色体。Andrew将着丝粒、复制原点、基因标记和端粒在一个酵母质粒上联合起来。令人惊奇地，这个和后来的工作展示了已知染色体元素完全的补足对本身的有丝分裂是不足的，并且最小长度的DNA也是被要求的。人工染色体初始的工作为了后来高效运作的的染色体设臵了一个平台为理解细胞内在有丝分裂和减数分裂期确保稳定的核遗传的染色体机制打下良好的基础。人工染色体后来被用来克隆酵母中特殊的长DNA碎片，它们在人类基因组分析中也变成了最根本的工具。 一些不寻常的事件发生在末端

直接增加到在酵母线性质粒的四膜虫端粒的酵母序列的增加、在四膜虫的重组端粒的增加和端粒长度的不均一暗示了一个可能涉及端粒维持的不寻常的过程。此外,奇怪的端粒在

锥体虫在培养基里生长时候的生长的事实也暗示了有些不寻常的事在末端发生。到1983年为止，有两种对于生成端粒长度的不均和维持端粒长度的分子机制的竞争模型。一个模型提出有个不知名的酶在合成末端。另一个模型提出端粒重复的增加通过一个重新联合-调节的过程出现。重新联合是一个构建良好的进程，而这个对端粒重复增加的机制似乎是言之可行。为了区分这两种机制。直接的实验证据是需要的。 端粒酶的发现

端粒酶的生化证据来自由Liz Blackburn的实验室的Carol Greider实施的一系列实验。Carol1984年以研究生的身份加入了Liz的实验室，并且她开始研究端粒如何复制和来调研是什么物质造成了序列在四膜虫、酵母和锥体虫内的增加。在Liz和她研究生学生Peter Challoner的前期实验之后，Carol开始了生化实验来寻找端粒增加酶的证据。Carol通过增加DNA研制碎片和放射性核苷酸到四膜虫细胞提取来判定是否一个在限制碎片的一个末端的端粒序列能被优先标记来开始研究。这些实验起初展示了很有潜质的结果。然而，邻近的检验展示出标记是由于著名的DNA聚合酶活动。Carol因此尝试了各种底物和反应条件来探究是否存在一个只在端粒序列下表达的活动。

当1984年12月Carol利用一个合成DNA寡核苷酸作为底物反应时，这才有了突破。合成的寡核苷酸呈现了一种不同的可以也在比限制碎片更高度集中的被添加的分子底物。她添加DNA寡核苷酸（TTGGGG）4 到包含的放射性dGTP的非碎片细胞提取物。当产物在

定序凝胶上被依形切分时，一个六碱基重复阶梯周期性的出现在凝胶上，我们现在这个实验起作用，因为端粒寡核苷酸底物对比于早期使用限制碎片的实验来说有更高的集中呈现。

酵母端粒在四膜虫提取物：证据圆满

生成一个六碱基重复的方式的活动的第一个线索是令人兴奋的。Carol和Liz然后开始探究是否这个重复方式是由于一个新的酶还是一个在细胞抽提物中可能使用加入寡核苷酸和复制内生的端粒重复已建立的DNA多聚酶。Carol用不同的方式来排除作为一个模板的内共生DNA。首先，她展示了延长的活动是对端粒序列专一的，因为一个寡核苷酸和一个不相关的序列在反应中是不扩增的。当Carol和Liz决定做一个Szostak和Blackburn跨越界的端粒功能实验的反转，关键的实验产生了：这次是在四膜虫抽提物。他们使用了由酵母端粒序列重复组成的合成寡核苷酸序列。这个24碱基寡核苷酸在3尾端拥有序列TGGG，但在其它方面和四膜虫重复没有丝毫关联。实验展示了不仅仅是酵母端粒在提取物中高效地延长了，而且在溶胶的重复方式是上移了一个碱基单位。（Fig.2a.）这是个令人兴奋的突破，以至于使Carol和Liz最后相信这个活动实际上是个独立的端粒合成酶。在连接方式的一个碱基漂移是由于四膜虫酶正确的合成（TTGGGG）3序列。因为四膜虫底物（TTGGGG）3有4G在末端，并且酵母寡核苷酸，所以它不得不在TTGGGG重复方式该被继续前由额外的G扩展。这个导致了在全部键连方式的向上的扩展----引人注意的证据就是这个活动是个专一端粒末端转移

运动。在后期论文，这个酶的名字被简写成端粒酶。 端粒酶：序列是如何被专一性识别的？

已经知道了新近发现的端粒合成活动后，下一个最重要的问题是端粒序列是如何被专一是别的。一个可能的模型是可能有一个核酸成分来识别端粒重复。实际上，提取核糖核酸酶的处理废除了这个活动。一个复杂的系列控制最终解释了这个活动的丢失不是人工行为：这个酶含有一个基本的RNA成分。然而，发现这个专一的RNA是需要巧妙技术的。Carol 打算纯化端粒酶，测序那些联通纯化酶活动的RNA序列。几年的冷板凳工作也促成了高度纯化的碎片提取，但是RNA始终难以理解的。在转移到在Cold Spring Harbor 实验室的一个独立的位臵后，Carol才能够用来自从联通纯化的RNA的部分序列信息来克隆端粒酶的RNA成分。在一个克隆中，序列CAACCCAA在测序凝胶的出现很快示意了成功。Carol然后就打算测试这个RNA是否在酶活动中是要求有的。她积累了不仅是RNA 联通纯化端粒酶的证据，还有阻断CAACCCCAA的寡核苷酸提示了模板区域也阻断了酶活动。在模板区域九个核苷酸的出现暗示了一个端粒酶可能合成串联TTGGGG重复的机制。这个模型在1989年被提出，至今还是被作为端粒酶活动的一个认可的机制。

Carol将克隆的RNA基因送回给在伯克利的Liz。在Liz实验室的研究生Guo-Liang Yu和John Bradley制作了模板的突变体。Guo-Liang利用他设计的新型导航系统 通过显微注射基因到四膜虫在四膜虫细胞里过度表达突变端粒酶。他发现在这些细胞的端粒包含更改的端粒重复序列。这明确地展示了端粒酶利用CAACCCCAA模板序列来指定端粒重复的增加，也因此建立了他的在体内和体外行为的逆转录模型。 酵母端粒酶的证据

与生化努力来证实四膜虫的端粒酶组成的研究同时，在Jack实验室的Vicki Lundblad着手于在酵母突变缺失的端粒修复上的基因筛选。最有意思的突变体有个表型预测在端粒修复上一个不完全 ------一个连续的端粒DNA缩短。因为从头到尾链上端粒不断变短，所以该基因被称为EST1（ever shorter telomeres）。最令人满足的是，这个链也允许一个衰老延迟表型，在这个基因下，这如逐渐的端粒减少所预测的那样，正常的时代生长会有染色体减少和生长电势显著减少增加的趋势。当时还不知道EST1是否和端粒酶或者在端粒修复中扮演着什么其他的角色。

在定性分析四膜虫端粒酶RNA突变体时，Liz发现一个突变体有个平行于酵母EST1的突变表型。这个模板突变在体内多少阻断了所有DNA增加到端粒末端。相反，端粒还是照常变短，细胞生长了20到25个细胞，然后开始衰老（停止分裂）。这个结果支持了在酵母的EST1突变也许实际上是个端粒酶突变，因为它的表型是如此的和四膜虫端粒酶突变体相似。总之，这些实验建立了一套理论，一个有功能的端粒酶对酵母和四膜虫的不确定复制能力是必需的。

对酵母端粒酶的生化认知来自在Liz实验室的博士后Marita Cohn 和John prescott。一个一开始的令人困惑的结果是在体外活动中不需要EST1的参与。然而，随后的生化证据表明Est1 蛋白实际上是酵母端粒酶复合体的一个成分，虽然它不是一个催化成分。后来被Vicki Lundblad 发现的EST2基因，证明是编码催化亚基的。EST2是和Joachim Lingner和Tom Cech提纯和确认的纤毛端粒酶是同源的，导致他们中的三个展示了EST2编码了端粒酶的催化蛋白成分-----端粒酶逆转录酶。（TERT） 在癌症和细胞复新中的端粒

在四膜虫和酵母发现的端粒酶是纯好奇驱动的研究，没有任何医学方面的影响。然而马上改变了。虽然人类端粒的序列要花长时间来测定，但已有证据表明它们有结构的相似性。1988年，人类端粒序列被测定为TTAGGG的简单重复，非常相似于四膜虫重复的。这个和人类端粒酶的确认激发了两个领域的研究：细胞衰老和癌症。Alexei Olovnikov 曾预测末端

重复问题将导致也许是限制细胞衰老培养上的纤维母细胞细胞分裂潜力原因的端粒缩短。Carol和Clavin Harley合作，发现端粒缩短的确在人类细胞培养中发生。这是由于缺少端粒酶表达和随之发生的不可行的正常端粒的维持。如果端粒酶在这些细胞表达，那么端粒不缩短，细胞不衰老。因此，短的端粒可以限制细胞分裂的能力，暗示着端粒酶抑制可以限制癌细胞的生长。

这个端粒在癌症中作用的想法被两个独立的小组进行着进一步的验证。Nick Hastie和Titia de Lange两个都展示了端粒在癌细胞中要比在正常组织中小。这个缩短可能是由于大量的癌细胞在没有有效端粒酶的作用下细胞复制的结果。癌细胞为了克服装着非常短的端粒细

胞分裂的限制，端粒酶必须表现得允许端粒修复。随后端粒酶在人肿瘤细胞的活跃但在大部分正常细胞的不可检测的示例更加加强了端粒酶一直是个很好的杀死癌细胞的方式。

这些初始的发现激励了癌症团体来研究端粒酶在各种类型肿瘤细胞的活动，这也导致了一系列关于端粒酶的出版物的激增。（Fig.3）随后利用培养的人细胞和一个端粒酶淘汰的老鼠模型的工作证实了端粒酶表达限制可以限制癌细胞分裂和肿瘤产生。然而，在一些情况

下端粒功能的缺失可能导致染色体的重组以至于加速肿瘤进程。决定端粒酶抑制是否将会高效地作用专一种类的癌症的通路细节还仍未探究清楚。这是当今相当复杂且富足的研究领域。

多长的端粒酶才足够？

整个90年代持续的端粒酶的生化研究产生了一个全新的发现：短端粒在基因疾病上有着自己的角色。人类端粒酶RNA成分的结构包括一个在不相关等级表现的小RNA模体，也就是snoRNA。这个模体连接着一个在核糖体RNA修正作用的叫dyskerin的蛋白。Dyskerin突变体成为了X关联的被以不正常的皮肤和骨髓失败识别的人类基因病dyskeratosis congenita的基础。这个dyskerin与端粒酶的初步联系为一条常染色体dyskeratosis congenita统治形式是由于人类端粒酶RNA突变体造成的理论铺设了道路。

显然在端粒酶RNA和蛋白质成分的突变在人类世代交替中导致进程性的端粒缩短，着也限制了组织复新的能力。这个限制的组织复新表明dyskeratosis congenita、先天性贫血和其它依赖于组织的综合症是在个体中最受影响的。最令人震惊的关于常染色体显性遗传的方式的事是它暗示了一个端粒酶的功能性复制对端粒维持是不高效的。实际上，Carol的实验室在老鼠身上通过展示拥有半数正常端粒酶导致进程化的端粒缩短和组织复新的能力的缺失直接证实了这一点。这暗示了显著的端粒酶能力来认出和高效的延伸端粒是严格地在细胞中受限的。旨在理解限制端粒延伸的机制和为什么端粒酶活动在哺乳动物中如此紧凑规律的实验暗示着在未来几年更多惊奇的端粒酶发现。 好奇心驱使的研究的力量

端粒功能分析的故事、端粒酶的发现和两者初始的不可预见性说明了许多道理。首先，和不同领域的人交流是很有价值的。随着科学学科的专业化发展----也许不可避免的，作为一种知识增加的结果----科学家会保持紧密联系和自己相关领域。但是如癌症、传染性疾病及老化等大问题将不会仅仅通过一个生物系统的一方面研究来解决；如此明确的工作是必需的，但不足。我们可以清楚的看到这一点，例如，最新关于生物老化的进展包含了从酵母到

人类的物种研究对存在的过程是起决定性的作用的。此外，系统生物学的出现有助于一体化全新的和不过清楚的技术上到我们方法论的全部设备上来，例如网络建筑的数学分析。

另一个重要的课题是高风险、高投入的实验的价值。当我们首次探讨放臵四膜虫端粒到酵母中去的主意的时候，实验似乎不可能管用。毕竟，这些生物体是在较远关系的类群里，并且它们的细胞生理状况是显著不同的。然而，大量的实验工作表明在所有被研究的真核生物中，在染色体端点的DNA末端是不同寻常的。基于可能有某些端粒复制和固定的机制，真核生物的机制是保守的这一说法是有可能的。同样地，起初试图寻找四膜虫端粒酶的实验在那时看来也是冒风险的。实验的成功也说明了在‘非标准’的有机体实验的价值----我们如果只是专注于一些已经探寻清楚的模型系统的话将会失去许多。我们可以从生物的多样性中学到这么多的道理。生物学有时通过一些看起来晦涩难解的甚至奇异的东西来揭示普遍的原则。但在进化中，在机械和分子水平上，功能通常是基础地保守的，改变的只是长度和坐落各种分子进程被释放的位臵。因此，那首先看起来像个生物学例外的东西经常证实是更基本的分子进程的表现。有纤毛的原核生物和他们的端粒、端粒酶就是这种情况。

更广泛的说，端粒酶研究的安静开始强调了基础的、兴趣驱使的研究的重要性。在被实施的那时，如此研究是没有什么明显的实际应用价值的。我们理解这世界运转的方式是片面的和不完全的，也就是事情都不会以一种简单直接线性的方式进行。联系不联系的、敢飞敢冒险、敢享受交流的快感和敢玩弄一开始会被认为是奇异的想法是很重要的。基础学科的突破是受刺激于不可解释的在应用工作进程出现的现象并且在理解上结果性的成长指导我们的注意力放到新研究的大道上。这种基础学科和应用的交互的循环是自发的，并且极大地贡献于科学知识爆发性的增长。如果通过一个对基础学科错误的认识这个循环被打破，那么在更应用的科学、医药、工程领域的进程继续也会明确地受限。