元素组成：CH2O
多羟基的醛类或酮类化合物，以及它们的衍生物或聚合物。醛糖 酮糖
（一）物理性质
1.旋光性：是鉴定糖的一个重要指标 变旋
在溶液中，糖的链状结构和环状结构(、)之是可以相互转变，最后达到一个动态平衡，称为变旋现象。
2.甜度：以蔗糖的甜度为标准
3.溶解性：易溶于水而难溶于乙醚、丙酮等有面溶剂
2、单糖的性质 (二) 化学性质 1、 异构化
在弱碱性溶液中，D-葡萄糖、D-甘露糖和D-果糖，可以通过烯醇或而相互转化 图7.15
2、 氧化反应
醛基氧化：醛糖酸(aldonic acid)
醛基、伯醇基同时氧化：醛糖二酸(alduric acid)
伯醇基氧化：糖醛酸(uronic acid)
还原性糖：能被弱氧化剂(如Fehling试剂、Benedict试剂)氧化的糖 3、 还原反应
单糖的羰基在适当的还原条件（硼氢化钠或钠汞齐）下，被还原成多元醇 4、 糖脎反应(亲核加成)
还原糖生成含两个苯腙基的衍生物，称为糖的苯脎或脎，即糖脎。 糖脎反应发生在醛糖和酮糖的链状结构上。
糖脎为黄色结晶，难溶于水。各种糖生成的糖脎结晶形状与熔点都不相同，因此，
常用糖脎的生成以鉴定各种不同的糖。
5. 形成糖脂与糖醚 （1）. 成脂
通常是在碱催化下用酰氯或酸酐进行的
磷酸糖酯及其衍生物是糖的代谢活性形式(糖代谢的中间产物)。 葡萄糖的核苷二磷酸酯，如UDPG参与多糖的生物合成。 （2）.成醚
在甲基亚磺酰甲基钠存在下用碘甲烷或在碱性条件下用硫酸二甲酯处理糖或糖苷可
得到它的甲醚衍生物，此反应也常称为糖的甲基化。
6. 形成糖苷
环状单糖的半缩醛（或半缩酮）羟基与另一化合物发生缩和形成的缩醛（或缩酮）称为糖苷
1
或苷。
7、单糖脱水（无机酸的作用）（ 糠醛反应(HCl)）
(1) Molish反应
糖脱水生成的糠醛及其衍生物能与α－奈酚反应生成红紫色的缩合物 Molish反应可以鉴定单糖的存在。 (2) Seliwannoff反应
酮糖 HCl、间苯二酚 红色 醛糖 HCl、间苯二酚 浅色 3、淀粉
① 直链淀粉：长而紧密的螺旋管形。遇碘显蓝色，葡萄糖单位通过α－1,4连接的线形分子 ② 支链淀粉：不能形成螺旋管，遇碘显紫色。
高度分支，线形段也是α－1,4连接，分支点处为α－1,6连接 淀粉链倾向形成规则的螺旋构象 4、糖原
结构与支链淀粉很相似，不同的是分支程度更高，分支链更短，每隔8～12个葡萄糖残基便有一个分支含有大量的非还原性端，可以被迅速动员水解。 遇碘显红褐色。 5、纤维素：-D-葡萄糖分子以-(1-4)糖苷键相连而成直链。
磷脂卵磷脂甘油磷脂磷脂鞘磷脂鞘糖脂脑磷脂心磷脂鞘脂类神经酰胺脑苷脂鞘胺醇磷脂酸神经节苷脂甘油磷脂结构甘油的第三个羟基被磷酸、另两个羟基为脂肪酸酯化，继而磷酸再与氨基醇（如胆碱、乙醇胺或丝氨酸）或肌醇结合。6、甘油磷脂是由sn-甘油-3-磷酸衍生而来，最简单的甘油磷脂是3-sn-磷脂酸，它是其它甘油磷脂的母体。
2
甘油磷脂两个长的碳氢链构成它的非极性尾部，其余部分构成它的极性头部。 7、蛋白质的水解
酸水解：H2SO4或HCl水解。不消旋，得到L－氨基酸。但，色氨酸被破坏，天冬酰胺、
谷胺酰胺脱酰胺基
碱水解：消旋，得到D、L氨基酸，精氨酸脱氨，生成鸟氨酸和尿素。但，色氨酸稳定 酶水解：不消旋，不破坏氨基酸。水解位点特异，用于一级结构分析，肽谱 8、编码的蛋白质氨基酸（20种） 结构通式：
共同点：与羧基相邻的α－碳原子（Cα）上都有一个氨基，因此称为α－氨基酸。 连接在碳上的还有一个氢原子和一个可变的侧链，称R基。
氨基酸在中性pH时，羧基以－COO－，氨基以－NH3＋形式存在，这样的氨基酸分子含有一个正电荷和一个负电荷，称为兼性离子 9、氨基酸的分类
基本氨基酸（编码的蛋白质氨基酸）：组成蛋白质，20种， 稀有氨基酸：是多肽合成后由基本aa经酶促修饰而来。
非蛋白质氨基酸：存在于生物体内但不组成蛋白质 (约150种)。 10、氨基酸符号见书上 11、氨基酸的分类
按照R基的化学结构分类 （1）、R为脂肪烃基的氨基酸（5种）
3
R基均为中性烷基，R基对分子酸碱性影响很小，它们几乎有相同的等电点。（6 .0±0.03） Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性 从Gly至Ile，R基团疏水性增加 （2）、R中含有羟基和硫的氨基酸（共4种）
Ser的-CH2 OH基（pKa=15）在生理条件下不解离， 但在大多数酶的活性中心都发现有Ser残基存在。
Ser和Thr的-OH往往与糖链相连，形成糖蛋白。 ★Cys的R中含巯基（-SH）， 具有两个重要性质： （1）在较高pH值条件，巯基离解。
（2）两个Cys的巯基氧化生成二硫键，生成胱氨酸。 ★Met在生物合成中是一种重要的甲基供体。 （3）、R中含有酰胺基团（2种） Asp侧链羧基pKa为3.86，
Glu侧链羧基pKa为4.25
它们是唯一在生理条件下带有负电荷的两个 氨基酸
酰胺基中氨基易发生氨基转移反应 （4）、R中含有酸性基团（2种）Asp、Glu （5）、 R中含碱性基团（3种）(少组氨酸) Lys侧链氨基的pKa为10.53，生理条件下，Lys侧链带有一个正电荷（—NH3+），侧链的氨基反应活性增大。
Arg是碱性最强的氨基酸，侧链上的胍基是已知碱性最强的有机碱，pKa值为12.48，生理条件下完全质子化。
His是pKa值最接近生理pH值的一种（游离氨基酸中为6.00，在多肽链中为7.35 ） ，是在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸。
His在酶的酸碱催化机制中起重要作用
4
（6）、芳香族氨基酸（7）、杂环族氨基酸（1种）
苯丙氨酸酪氨酸色氨酸280nm处，Trp吸收最强，Tyr次之，Phe最弱。Pro的α-亚氨基是环的一部分，因此具有特殊的刚性结构。
一般出现在两段α-螺旋之间的转角处，Pro残基所在的位置必然发生骨架方向的变化
必需氨基酸：
成年人：Thr、 Val、 Leu、Ile、 Phe 、Trp、Lys、 Met 婴儿期：Arg和His供给不足，属半必须氨基酸 2、按照R基的极性性质可以分为4类： 侧链极性(疏水性程度) （1）、 非极性氨基酸 9种
在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用（蛋白质的疏水核心）。
非极性R基氨基酸有些人将甘氨酸归入“不带电荷的极性R基氨基酸”中。甘氨酸丙氨酸缬氨酸P127亮氨酸甲硫氨酸异亮氨酸
苯丙氨酸 脯氨酸 色氨酸
5
6种这类氨基酸的侧链都能与水形成氢键，因此很容易溶于水2）、不带电何的极性氨基酸甘氨酸丝氨酸苏氨酸半胱氨酸酪氨酸天冬酰胺谷氨酰胺
3）、带负电荷的aa(酸性aa)4）、带正电何的aa(碱性aa)天冬氨酸谷氨酸赖氨酸精氨酸组氨酸胶原蛋白中的Lys侧链氧化时能形成很强的分子间(内)交联。 Arg的胍基碱性很强，与NaOH相当。
His是一个弱碱，是天然的缓冲剂，它往往存在于许多酶的活性中心。 非极性aa一般形成蛋白质的疏水核心，带电荷的aa和极性aa位于表面。 酶的活性中心：His、Ser、Cys （二） 非编码的蛋白质氨基酸
也称修饰氨基酸，是在蛋白质合成后，由基本氨基酸修饰而来。 （1）4-羟脯氨酸 （2）5-羟赖氨酸 这两种氨基酸主要存在于结缔组织的纤维状蛋白中。
（3）6-N-甲基赖氨酸（存在于肌球蛋白中） (4)γ-羧基谷氨酸 存在于凝血酶原及某些具有结合Ca2+离子功能的蛋白质中。
（5）Tyr的衍生物： 3.5 -二碘酪氨酸、甲状腺素 （甲状腺蛋白中） （6）锁链素由4个Lys组成（弹性蛋白中）。 （三） 非蛋白质氨基酸 P85
6
不组成蛋白质，但有生理功能
（1）L-型α –氨基酸的衍生物：L瓜氨酸、L-鸟氨酸是尿素循环的中间物 （2）D-型氨基酸
D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短杆菌肽S） （3）β-、γ-、δ-氨基酸
β-Ala（泛素的前体）、γ-氨基丁酸（神经递质）。 12、氨基酸的酸碱性质（重点）
1. 氨基酸在晶体和水溶液中主要以兼性离子形式存在
①晶体溶点高 →离子晶格，不是分子晶格。 ②不溶于非极性溶剂 →极性分子 ③介电常数高→ 水溶液中的氨基酸是极性分子。
离子晶格 维系力 异性电荷间 静电吸引 作用力大 熔点高 分子晶格 维系力 分子间 范德华力 作用力小 熔点低
13、氨基酸的水解见李课件 14、等电点见李课件 15、甲醛滴定见李课件 16、化学形式见李课件
（氨基酸一个反应式子）
Edman反应式子
7
生成西佛碱的反应式子
17、蛋白质的共价结构
一、 蛋白质的化学组成与分类
8
1、 元素组成
碳 50% 氢7% 氧23% 氮16% 硫 0-3% 微量的磷、铁、铜、碘、锌、钼 18、凯氏定氮：粗蛋白质含量=蛋白氮×6.25 2、 氨基酸组成
蛋白质是由20种L-型α氨基酸组成的长链分子 3、 分类
（1） 按组成：
单纯蛋白：仅含氨基酸，不含其他成分
缀合蛋白：除含氨基酸外，含有其他成分 非蛋白部分称为辅基或配体 详细分类，P 75 表 3-1，表 3-2。（注意辅基的组成）。 （2）、按分子外形的对称程度：
球状蛋白质 、 纤维状蛋白质、膜蛋白质 （3）、按功能分：
酶、运输蛋白、营养和贮存蛋白、激素、受体蛋白、运动蛋白、结构蛋白、防御蛋白。 二、 蛋白质的大小与形状
少于50个aa的低分子量aa多聚物称为肽，寡肽或生物活性肽，有时也罕称多肽。 一条多肽链——单体蛋白
两条或多条多肽链——寡聚或多聚蛋白质；每条多肽链称为亚基或亚单位，亚基间通过非共价键相互缔合
蛋白质分子量= aa数目*110
三、 蛋白质分子的构象与结构层次
蛋白质都有自己特有的天然空间结构，称为构象。 一级结构： 氨基酸顺序
二级结构 ：肽链连接，氢键；α螺旋、β折叠、β转角；规则结构，螺圈，一维方向伸展 三级结构： 肽链连接，非共价键；α螺旋、β折叠、β转角、松散肽段；特定走向，紧密
球状构象
四级结构 ：多亚基聚集
一级结构二级结构三级结构四级结构氨基酸残基α螺旋多肽链多聚亚基 9
四、 蛋白质功能的多样性 1． 酶
2．结构成分（结缔组织的胶原蛋白、血管和皮肤的弹性蛋白、膜蛋白） 3．贮藏（卵清蛋白、种子蛋白）
4．物质运输（血红蛋白、Na+-K+-ATPase、葡萄糖运输载体、脂蛋白、电子传递体） 5．细胞运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白）
6．激素功能（胰岛素） 7．防御和进攻（抗体、皮肤的角蛋白、血凝蛋白） 8．接受、传递信息（受体蛋白，味觉蛋白）
9．调节、控制细胞生长、分化、和遗传信息的表达（组蛋白、阻遏蛋白） 二、 肽和肽键的结构 肽：一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水缩合而成的化合物。其中的氨基酸单位称氨基酸残基。
多肽链一端含有一个游离的末端氨基，另一端含有一个游离的末端羧基。有时，末端基团连接成环状肽。
肽链具有极性，通常把NH2末端氨基酸残基放在左边，COOH末端氨基酸残基放在右边。 肽键：氨基酸间脱水后形成的共价键称肽键（酰氨键）
肽单位：酰胺平面，肽单位间以α-C原子相隔，构成肽链P111页 19、肽键的结构特点：
（1）酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基之间形成共振杂化体。 （2）肽键具有部分双键性质，不能自由旋转。
（3）肽键具有平面性，组成肽键的4个原子和2个Cα几乎处在同一平面内（酰氨平面）。 （4）肽键亚氨基在pH0---14内不解离。
（5）肽链中的肽键一般是反式构型，而Pro的肽键可能出现顺、反两种构型． 多肽链可以看成由Cα串联起来的无数个酰胺平面组成 三、 肽的重要性质 1、 旋光性
一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和。 2、 肽的酸碱性质
短肽在晶体和水溶液中也是以偶极离子形式存在。
肽的酸碱性质主要取决于Ｎ端α－ＮＨ２和Ｃ端α－COOH以及侧链Ｒ上可解离的基团。 在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。
优势离子的净电荷：<3.5 +23.5-4.5 +14.5-7.8 07.8-10.2 -1>10.2 -2等电点：Pi=（4.5+7.8）/2=6.15 10
20、蛋白质一级结构测定 （一）蛋白质测序的基本策略
对于一个纯蛋白质，理想方法是从N端直接测至C端，但目前只能测60个N端氨基酸。 1、 直接法（测蛋白质的序列） 两种以上特异性裂解法
N C A 法裂解 A1 A2 A3 A4 B 法裂解 B1 B2 B3 B4 2、 间接法（测核酸序列推断氨基酸序列） （二） 蛋白质测序的一般步骤 P168 （1）测定蛋白质分子中多肽链的数目 （6） 多肽链部分裂解成肽段。 （2） 拆分蛋白质分子中的多肽链。 （7） 测定各个肽段的氨基酸顺序 （3） 断裂链内二硫键。 （8） 确定肽段在多肽链中的顺序。 （4） 分析多肽链的N末端和C末端。 （9） 确定多肽链中二硫键的位置。 （5） 测定多肽链的氨基酸组成。 （三） 测序前的准备工作 1、 蛋白质的纯度鉴定 纯度97%以上，均一。
⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)要求一条带
⑵DNS—cl（二甲氨基萘磺酰氯）法测N端氨基酸
2、测定分子量，估算氨基酸残基数，确定肽链数 SDS-PAGE
凝胶过滤法 沉降系数法 3、 确定亚基种类及数目
根据分子量和N末端数 、 SDS-PAGE 4、拆分多肽链，并分别分离纯化
⑴非共价键结合：8mol/L尿素， SDS-PAGE ⑵二硫键结合：
过甲酸氧化： —S—S— + HCOOOH → SO3H β巯基乙醇还原 5、 测定氨基酸组成
酸水解的同时辅以碱水解。
确定肽链中各种a.a出现的频率,便于选择裂解方法及试剂。 21、端基分析 ①N端分析
★DNS-cl法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。
★DNFB法：Sanger试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色DNP-氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等
★ PITC法：Edman法，逐步切下。无色PTH-氨基酸，有机溶剂抽提，层析。
氨肽酶法：肽链外切酶或叫外肽酶。使用有困难。酶对各种肽键敏感性不一样，常难以判断
哪个残基在前，哪个在后。
22、②C端分析 ★肼解法
无水肼NH2NH2 100℃ 5-10h。
11
苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游离氨基酸留在上清中。 Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。
★羧肽酶法（Pro不能测） 肽链外切酶，从C末端开始。
羧肽酶A：除Pro、Arg、Lys外的所有C端a.a
羧肽酶B：只水解Arg、Lys N
H2N… … … … …Val—Ser—Gly C
图 P118 羧肽酶法测C末端
（四） 肽链的部分裂解和肽段的分离纯化 1、 化学裂解法
①溴化氰 —Met—X— （羧基端） 产率85% ②羟胺NH2OH —Asn—Gly— pH9 约150个氨基酸出现一次 2、 酶法裂解
①胰蛋白酶 Lys——X (X ≠ Pro) Arg—— X 减少胰蛋白酶作用位点：
马来酸酐——保护Lys残基羧基端，只能断裂Arg残基羧基端 1,2—环己二酮——修饰Arg的胍基，只能断裂Lys残基羧基端 增加胰蛋白酶作用位点：氮丙啶——Cys修饰成类似Lys残基羧基端，能断裂Cys ②糜蛋白酶 Tyr——X (X ≠ Pro) Trp——X Phe——X 胃蛋白酶：两侧残基均为疏水性氨基酸
Phe(Trp、 Try、 Leu)——Phe(Trp、 Try、 Leu) ③葡萄球菌蛋白酶（Glu蛋白酶） Glu——X ④梭菌蛋白酶（Arg蛋白酶） Arg——X
⑤Lys蛋白酶 X——Lys ⑥Pro蛋白酶 Pro——X 3、 肽段的分离纯化
①电泳法 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ： 根据分子量大小分离
②离子交换层析法（DEAE—Cellulose、DEAE—Sephadex）根据肽段的电荷特性分离 ③反相ＨＰＬＣ法 ：根据肽段的极性分离 ④凝胶过滤
要求： ＳＤＳ－ＰＡＧＥ单带、 ＨＰＬＣ单峰 、Ｎ端单一（常用ＤＮＳ－c l法）
12
（五） 肽段序列测定及肽链的拼接 1、 Edman法 （1）耦联
PITC ＋ H２N—A-B-C-D pH8—9，40℃ PTC——A-B-C-D
（2）裂解 ：无水三氟乙酸（TFA） ATZ—A + H2N—B-C-D （3）转化 ：PTH—A PTC肽：苯氨基硫甲酰肽
ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸） PTH：苯乙内酰硫脲（一氨基酸）
2、 DNS-Edman法： 用DNS法测N末端，用Edman法提供（n-1）肽段 3、 有色Edman法
荧光基-团或有色试剂标记的PITC试剂。 4-N、N-二甲基氨基偶氮苯-4’异硫氰酸酯。 4、 用自动序列分析仪测序 仪器原理：Edman法。
1967液相测序仪： 自旋反应器，适于大肽段。 1971固相测序仪
表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的Ｃ端。 1981气相测序仪：用Polybrene反应器。（聚阳离子）四级铵盐聚合物 液相：5nmol 20-40肽 97% 气相：5pmol 60 肽 98% 6、 肽段拼接成肽链 16肽，Ｎ端H Ｃ端Ｓ
Ａ法裂解：ONS PS EOVE RLA HOWT Ｂ法裂解：SEO WTON VERL APS HO 重叠法确定序列：HOWTONSEOVER LAPS 重叠肽：跨切口重叠的肽段
23、 二硫键、酰胺及其他修饰基团的确定 1、 二硫键的确定（对角线电泳法）
胃蛋白酶酶解蛋白质：生成的肽段包括二硫桥的肽段较小防止二硫键发生交换反应 第一向电泳 ： 过甲酸氧化—S—S—生成-SO3H 第二向电泳 ： 分离出含二硫键的两条短肽，测序与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。 24、 酰胺的确定 Asp –Asn、Glu-Gln
酶解肽链，产生含单个Asx或Glx的肽，用电泳法确定是Asp还是Asn 举例：Leu-Glx-Pro-Val肽在pH=6.0 时，电荷量是 Leu+ Pro0 Val-
此肽除Glx外，净电荷为0，可根据此肽的电泳行为确定是Glu或是Gln。 （一） 蛋白质的一级结构决定高级结构和功能 ★牛胰RNase变性一复性实验： 124个a.a残基 4个链内二硫键。
分子量：12600
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(8M尿素+β硫基乙醇)变性、失活→透析后构象恢复， 活性恢复95%以上，而二硫键正确复性的概率是1/105。 （二） 同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化 25、同源蛋白质：
在不同的生物体内行使相同或相似功能的蛋白质。 如：血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能，细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。 同源蛋白质的特点：
①同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性（序列同源性）
②有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称不变残基，不变残基高度保守，是必需的。
除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称可变残基，可变残基中，个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功能。 ③多肽链长度相同或相近
通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化。 亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。 蛋白质的三维结构
特定蛋白质行使其功能通常是由它的三维结构或构象决定的 一、研究蛋白质构象的方法 （一）X射线衍射法
（二）研究溶液中蛋白质构象的光谱学方法 1.紫外差光谱 3.圆二色性 2.荧光和荧光偏振 4.核磁共振（NMR） 26、稳定蛋白质三维结构的作用力 （一）氢键
在稳定蛋白质的结构中起极其重要的作用。
多肽主链上的羰基氧和酰胺氢之间形成的氢键，是稳定蛋白质结构的主要作用力 大多数蛋白质所采取的折叠策略是使主链肽基之间形成最大数目的分子内氢键，与此同时保持大多数能成氢键的侧链处于蛋白质分子的表面将与水相互作用
定向效应——极性分子或极性基团之间（氢键）广义范德华力诱导效应——极性物质与非极性物质之间分散效应——非极性分子或基团间仅有的一种范德华力，即狭义范德华力；通常范德华力就指此。（多数情况下，起主要作用的范德华力）吸引力范德华力与距离有关斥力近远（三）疏水作用（熵效应）
疏水作用（疏水效应）——水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分 子的内部
14
它在稳定蛋白质的三维结构方面占有突出的地位 疏水基团或疏水侧链出自避开水的需要而被迫接近
（四）盐键又称盐桥或离子键，是正负电荷之间的一种静电相互作用 （五）二硫键对构象的稳定起作用
27 、肽主链折叠的空间限制
从理论上讲，一个多肽主链能有无限多种构象。
但是，只有一种或很少几种天然构象，且相当稳定。 因为：天然蛋白质主链上的单键并不能自由旋转
、肽链的二面角★当Φ(Ψ)旋转键两侧的主链呈顺式时，规定Φ(Ψ) =0°★从Cα沿键轴方向看，顺时针旋转的Φ(Ψ)角为正值，反之为负值。★只有α碳原子连接的两个键（Cα—N和Cα-C）是单键，能自由旋转。★环绕Cα—N键旋转的角度为Φ环绕Cα—C键旋转的角度称Ψ2、 拉氏构象图：可允许的Φ和Ψ值 Φ和Ψ同时为0的构象实际不存在
二面角（Φ、Ψ）所决定的构象能否存在，主要取决于两个相邻肽单位中非键合原子间的接近有无阻碍。
Cα上的R基的大小与带电性影响Φ和Ψ
P206表5-3 蛋白质中非键合原子间的最小接触距离。 ▴ 拉氏构象图：
Ramachandran根据蛋白质中非键合原子间的最小接触距离，确定了哪些成对二面角（Φ、Ψ）所规定的两个相邻肽单位的构象是允许的，哪些是不允许的，并且以Φ为横坐标，以Ψ为纵坐标，在坐标图上标出，该坐标图称拉氏构象图。 ⑴实线封闭区域 一般允许区，非键合原子间的距离大于一般允许距离，此区域内任何二面角确定的构象都是允许的，且构象稳定。 ⑵虚线封闭区域 是最大允许区，非键合原子间的距离介于最小允许距离和一般允许距离之间，立体化学允许，
15
但构象不够稳定。 ⑶虚线外区域
是不允许区，该区域内任何二面角确定的肽链构象，都是不允许的，此构象中非键合原子间距离小于最小允许距离，斥力大，构象极不稳定。
对非Gly 氨基酸残基，一般允许区占全平面的7.7%，最大允许区占全平面20.3％ 四. 二级结构：多肽链折叠的基本规则方式
蛋白质主链的折叠产生由氢键维系的有规则的构象，称为二级结构 28、α螺旋
（1）. α螺旋的一般特征：
★多肽主链按右手或左手方向盘绕，形成右手螺旋或左手螺旋，
★相邻的螺圈之间形成链内氢键
★构成螺旋的每个Cα都取相同的二面角Φ、Ψ。
每圈螺旋占3.6个氨基酸残基，沿螺旋轴方向上升0.54nm。
每个残基绕轴旋转100°C，沿轴上升
0.15nm。
典型的α螺旋有如下特征： ① 二面角：Φ= -57°, Ψ= - 48°，是一种右手螺旋 ② ② 每圈螺旋：3.6个a.a残基， 高度：0.54nm
③ 每个残基绕轴旋转100°，沿轴上升0.15nm ④ 氨基酸残基侧链向外 ⑤ 相邻螺圈之间形成链内氢链，氢键的取向几乎与中心轴平行。
⑥ 肽键上C=O氧与它后面（C端）第四个残基上的N-H氢间形成氢键。 典型的α螺旋用3.613表示，
3.6表示每圈螺旋包括3.6个残基 13表示氢键封闭的环包括13个原子。 （2）、 右手α-螺旋与左手α-螺旋 右手螺旋比左手螺旋稳定。
蛋白质中的α—螺旋几乎都是右手，但在嗜热菌蛋白酶中有很短的一段左手α—螺旋，由Asp-Asn-Gly-Gly（226-229）组成（φ+64°、Ψ+42°）。 （3）、 α-螺旋结构的旋光性
α-螺旋结构是一种不对称的分子结构： （1）α碳原子的不对称性，（2） 构象本身的不对称性。 天然α—螺旋能引起偏振光右旋
α-螺旋的比旋不等于构成其本身的氨基酸比旋的加和，而无规卷曲的肽链比旋则等于所有氨基酸比旋的加和。
α-螺旋是有规则的构象，在折叠形成螺旋时具有协同性。一旦形成一圈α-螺旋，随后逐个加入变得容易而快速，这是因为第一个螺圈成为相继螺圈形成的模板。 （4）、 R侧链对α—螺旋的影响
① 多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸 残基,(如Lys，或Asp，或Glu)，不能形成稳定的α—螺旋。如多聚Lys、多聚Glu。 ② Gly在肽中连续存在时，不易形成α—螺旋。 ③ R基大（如Ile）不易形成α—螺旋 ④ Pro、脯氨酸中止α—螺旋。
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⑤ R基较小，且不带电荷的氨基酸利于α—螺旋的形成。如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自发卷曲成α—螺旋。 29、 β-折叠
两条或多条几乎完全伸展的多肽链（或同一肽链的不同肽段）侧向聚集在一起，相邻肽链主链上的NH和C=0之间形成氢链，这样的多肽构象就是β-折叠片。 （1）氢键与肽链的长轴接近垂直。（2）多肽主链呈锯齿状折叠构象 （3）侧链R基交替地分布在片层平面的两侧。
平行式：所有参与β-折叠的肽链的N端在同一方向。
反平行式：肽链的极性一顺一倒，N端间隔相同 反平β-折叠比平行的更稳定 30、 β-转角（β-turn）也称β-回折（reverse turn）、β-弯曲（β-bend） 球状蛋白质分子中出现的180°回折，由第一个a.a残基的C=O与第四个氨基酸残基的N-H间形成氢键。 β转角的特征：
①由多肽链上4个连续的氨基酸残基组成。②主链骨架以180°返回折叠。 ③第一个a.a残基的C=O与第四个a.a残基的N-H生成氢键
④C1α与C4α之间距离小于0.7nm ⑤多数由亲水氨基酸残基组成。 31、无规则卷曲
没有规律的多肽链主链骨架构象。往往与生物活性有关 五、纤维状蛋白质
含大量的α-螺旋，β-折叠片，整个分子呈纤维状
广泛分布于脊椎和无脊椎动物体内，起支架和保护作用。 32、结构域domain，motif(模块)
在二级结构及超二级结构的基础上，多肽链进一步卷曲折叠，组装成几个相对独立的、近似球形的三维实体。
结构域是球状蛋白的折叠单位
较小的蛋白质分子或亚基往往是单结构域的。 结构域一般有１００－２００氨基酸残基。
结构域之间常常有一段柔性的肽段相连，形成所谓的铰链区，使结构域之间可以发生相对移动。
结构域承担一定的生物学功能，几个结构域协同作用，可体现出蛋白质的总体功能。例如，脱氢酶类的多肽主链有两个结构域，一个为NAD+结合结构域，一个是起催化作用的结构域，两者组合成脱氢酶的脱氢功能区。
结构域间的裂缝，常是酶的活性部位，也是反应物的出入口 33、蛋白质的变性
蛋白质变性——天然蛋白质分子受到某些物理或化学因素的影响时，生物
活性丧失，溶解度降低，不对称性增高以及其他的物理化 学常数发生改变，这种过程就称为蛋白质变性。 实质——蛋白质分子中的次级键被破坏，引起天然构象解体。
不涉及共价键（肽键和二硫键等）的破裂，一级结构仍保持完好 蛋白质变性过程中，往往发生下列现象
（1）生物活性的丧失（2）一些侧链基团的暴露
（3）一些物理化学性质的改变——变性后，疏水基外露，溶解度降低， 一般在等电点区域不溶解，分子相互凝集，形成沉淀。
在碱性溶液中，或有尿素、盐酸胍等变性剂存在时，则仍保持溶解状态，透析除去这些变
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性剂，又可沉淀出来。
（4）生物化学性质的改变——变形后，分子结构伸展松散，易被蛋白水解酶分解。变性蛋白质比天然蛋白质更易受蛋白水解酶作用。
变性剂：尿素、盐酸胍以及一些去污剂（如，十二烷基硫酸钠（SDS））
变性是一个协同过程。它是在所加变性剂的很窄浓度范围内或很窄pH或温度间隔内突然发生的。
蛋白质的复性——当变性因素除去后，变性蛋白质又可重新回复到天然构象 二硫桥在稳定蛋白质构象中的作用
复性后的产物与天然RNA酶无区别，所有正确配对的二硫键都获得重建。复性过程中肽链上的8个SH基借空气中的氧重新氧化成4个二硫键时，它们的配对完全与天然的相同，准确无误。
RNA酶肽链上的一维信息控制肽链自身折叠成特定的天然构象，并由此确定了Cys残基两两相互接近的正确位置。
二硫桥对肽链的正确折叠并不是必要的，但它对稳定折叠态结构作出贡献。 34、 肌红蛋白的结构与功能： 肌红蛋白的三级结构
哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质。由一条多肽链（珠蛋白）和一个血红素辅基组成。 球状分子，单结构域。
8段直的α-螺旋组成，分别命名为A、B、C…H， 拐弯处是由1~8个氨基酸组成的松散肽段（无规卷曲）。
4个Pro残基各自处在一个拐弯处，另外4个是Ser、Thr、Asn、Ile。 血红素辅基 ，扁平状，结合在肌红蛋白表面的一个洞穴内。 只有亚铁态的蛋白质才能结合O2
、肌红蛋白的氧合曲线MbO2解离平衡常数：Mb+O2p255
K[Mb][O2][MbO2]K氧饱和度：[Mb]PO2[MbO2]YY[MbO2][MbO2][Mb]PO2KPO2 Y=0.5时，肌红蛋白的一半被饱和， PO2=K
= P50=2torr
解离常数K也称为P50，即肌红蛋白一半被饱和时的氧压。
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、Hill曲线和Hill系数Y1YPO2KlogY1YlogPO2logKP257 图6-7 Hill曲线Log[Y/(1-Y)]=0时的斜率称Hill系数（nH)表示配体结合部位之间在结合配体时的同促效应。肌红蛋白的nH=135 、血红蛋白的结构与功能： 在血液中结合并转运O2 1、 血红蛋白的结构：
成人： HbA： α2β2 98% ， HbA2： α2δ2 2% 胎儿： HbF α2γ2 早期胚胎： α2ε2
▲接近于球体，4个亚基分别在四面体的四个角上，每个亚基上有一个血红素辅基。 ▲α、β链的三级结构与肌红蛋白的很相似， 2、 血红蛋白的氧合曲线
四个亚基之间具有正协同效应，因此，它的氧合曲线是S型曲线
协同效应可增加血红蛋白在肌肉中的卸氧量，使它能有效地输送氧气。P50=26 torr，肺泡氧压：Po2Y=0.97=100 torr，肌肉毛细血管：Po2Y=0.25释放氧：=20 torr，△Y=0.97—0.25=0.72肌红蛋白（无协同效应）：△Y不足0.1 19
血红蛋白nH=1,无协同性nH＞1,正协同性肌红蛋白nH＜1,负协同性3、 波耳效应及其生理意义
血红蛋白上有CO2和BPG结合部位，因此，血红蛋白还能运输CO2 。
波耳效应：增加CO2的浓度、降低pH能显著提高血红蛋白亚基间的协同效应，降低血红蛋白对O2的亲和力，促进O2的释放，反之，高浓度的O2也能促使血红蛋白释放H+ 和CO2 。P264 图6-17 pH对血红蛋白氧合的影响 4、 BPG的别构效应
BPG是血红蛋白的负效应物。 BPG（2,3-二磷酸甘油酸）通过与它的两个β亚基形成盐键稳定了血红蛋白的脱氧态的构象，因而降低脱氧血红蛋白的氧亲和力。 无BPG时，P50=1 torr， BPG=4.5mM时，P50=26 torr
BPG进一步提高了血红蛋白的输氧效率。在肺部，PO2超过100torr，因此，即使没有BPG，血红蛋白也能被饱和，在组织中，PO2低，BPG降低血红蛋白的氧亲和力，加大血红蛋白的卸氧量。
（1）高山适应和肺气肿的生理补偿变化；BPG升高。 （2）血库储血时加入肌苷可BPG。
★协同效应、波耳效应、别构效应使血红蛋白的输氧能力达到最高效率 36、蛋白质的变性：理、化因素影响，使蛋白质生物活性丧失。 （1）变性的因素： 强酸和强碱； 有机溶剂：破坏疏水作用； 去污剂：去污剂都是两亲分子，破坏疏水作用； 还原性试剂：尿素、-硫基乙醇； 盐浓度：盐析、盐溶； 重金属离子：Hg2+、pb2+，能与-SH或带电基团反应。 温度； 机械力：如搅拌和研磨中的气泡。
（2）蛋白质变性后，往往出现下列现象： ①生物活性丧失
②硫水基团外露，分子结构伸展松散，易被蛋白酶水解。 ③溶解度降低、沉淀，粘度增加。 （2）变性的实质：
次级键（有时包括二硫键）被破坏，天然构象解体。变性不涉及一级结构的破坏 （5）可逆变性与不可逆变性
★制备活性蛋白质时严防蛋白质变性。
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37、蛋白质分离纯化的一般原则 P300
纯化的实质：增加制品(preparation)的纯度或比活性 一般程序：前处理、粗分级、细分级、浓缩与保存
前处理生物组织破碎、溶解、差速离心无细胞提取液粗分离选择性沉淀法离子交换层析疏水层析吸附层析凝胶过滤亲和层析细分离精制后的蛋白质
1、前处理：
①将组织和细胞破碎
动物组织和细胞：电动捣碎机 、 匀浆器 、超声波处理 植物组织和细胞：石英砂+提取液，研磨 纤维素酶处理 细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、溶菌酶处理（分解肽聚糖） ②差速离心法收集细胞的某一组分
P301 表7-5 在不同离心力下沉降的细胞组分
③如果提取膜蛋白：超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介质提取。 2、粗分级（rough fractionation)一般用选择性沉淀法。
①（NH4）2SO4分级沉淀法（盐析）②等电点选择性沉淀法
③有机溶剂分级沉淀法④热处理选择性沉淀法⑤生物碱或三氯乙酸选择性沉淀法 3、细分级（fine fractionation)
①透析除盐②sephdex G-25凝胶过滤除盐
★层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水层析（反相HPLC） ★电泳法：自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、滤纸和薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳等）、盘状电泳、等电聚焦、双向电泳★密度梯度离心 4、浓缩与保存 浓缩方法： 保存方法： ①晶体保存：
结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯度 的一个指标，也是判断制品是否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越容易结晶。
结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机溶剂、调节pH、接入晶种。 ②冻干粉保存：
③溶液保存：加入抗冻剂（50%甘油）后-20~-70℃保存。
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38、SDS—PAGE（十二烷基硫酸钠——聚丙烯酰胺凝胶电泳） 39、转换数
TN)或催化常数（Kcat)表示酶的最大催化效率Kcat是一定条件下（[S]》Km）每秒钟每个酶分子转换底物的分子数（数值上Kcat =K3）KK13ESESPEK2K4P 322 表8-2 一些酶的最大转换数（一） 酶的化学本质 绝大多数酶是蛋白质
证据（1）酸水解的 产物是氨基酸，能被蛋白酶水解失活；（2）具有蛋白质的一切共性，凡是能使蛋白质变性的因素都能使酶变性；（具有蛋白质的颜色反应） 少数酶是RNA（核酶）
★ ribozyme核酶（具有催化功能的RNA） （1）80年代初，Thomas Cech和Sidney Altman
四膜虫L19RNA具有生物催化功能，催化rRNA前体的剪接 （2）1983年 Atman和Pace
E.Coli RNase P中的RNA具有加工tRNA前体的催化功能 （二） 酶的化学组成
单纯酶类(simple enzyme)：仅由蛋白质组成
脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等 缀合酶类（conjugated enzyme):
全酶（holoenzyme)=脱辅基酶（apoenzye)+辅因子(cofactor)： 超氧化物歧化酶Cu2+、Zn2+）、乳酸脱氢酶（NAD+） ★ 酶的辅助因子主要有金属离子和有机化合物
金属离子：Fe2+、Fe3+ 、 Zn2+、 Cu+、Cu2+、 Mn2+、、Mn3+、Mg2+ 、K+、 Na+ 、Mo6+ 、Co2+等。
有机化合物：NAD，NADP，FAD，生物素，卟啉等 辅酶(coenzyme)：与酶蛋白结合较松，可透析除去。 辅基(prosthetic group)：与酶蛋白结合较紧。 P324 表8-4 金属离子作为一些酶的辅助因子 P325 表8-5 基团转移反应中的辅酶和辅基。
★酶蛋白决定酶专一性，辅助因子决定酶促反应的类型和反应的性质。
NAD+构成专一性强的乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶。 40、酶的分类 （三）、 单体酶、寡聚酶、多酶复合体、多酶融合体
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1、 单体酶
由一条或多条共价相连的肽链组成的酶分子
牛胰RNase 124a.a 单链 鸡卵清溶菌酶 129a.a 单链 胰凝乳蛋白酶 三条肽链 2、 寡聚酶
①含相同亚基的寡聚酶：苹果脱胱氢酶（鼠肝），2个相同的亚基 ②含不同亚基的寡聚酶：琥珀酸脱氢酶（牛心），αβ2个亚基
寡聚酶中亚基的聚合，有的与酶的专一性有关，有的与酶活性中心形成有关，有的与酶的调节性能有关。
★大多数寡聚酶是胞内酶，而胞外酶一般是单体酶。 3、 多酶复合体
★由两个或两个以上的酶，靠非共价键结合而成，其中每一个酶催化一个反应，所有反应依次进行，构成一个代谢途径或代谢途径的一部分。 大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体由三种酶组成：
①丙酮酸脱氢酶（E1） 以二聚体存在 2×9600 ②二氢硫辛酸转乙酰基酶（E2） 70000
③二氢硫辛酸脱氢酶（E3） 以二聚体存在 2×56000 12个E1 二聚体 24×96000 24个E2 单体 24×70000
6个E3 二聚体 12×56000 总分子量：560万 4、 多酶融合体（多功能酶）
★一条多肽链上含有两种或两种以上催化活性的酶，往往是基因融合的产物。 例如：天冬氨酸激酶I---高丝氨酸脱氢酶I融合体（双功能酶）
该酶是四聚体α4，每条肽链含两个活性区域：N-端区域是Asp激酶，C端区域是高Ser脱氢酶
41、酶的分类及命名 （一）、 习惯命名
1.依据底物来命名（绝大多数酶）：蛋白酶、淀粉酶 2. 依据催化反应的性质命名：水解酶、转氨酶 3 结合上述两个原则命名：琥珀酸脱氢酶。
4. 有时加上酶的来源 ： 胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶 （二）、 国际系统命名
★★基本原则：明确标明酶的底物及催化反应的性质（底物为水时可略去不写）。 ★P327 表8-8酶国际系统命名法举例
★★ （三）国际系统分类法及编号（EC编号）
（1）按反应性质分六大类，用1、2、3、4、5、6表示。
（2）根据底物中被作用的基团或键的特点，将每一大类分为若干个亚类，编号用1、2、3 。 （3）每个亚类又可分为若干个亚一亚类，用编号1、2、3表示。 每一个酶的编号由4个数字组成，中间以―·‖隔开。
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第一个数字表示大类，第二个数字表示亚类，第三个表示亚-亚类，第四个数字表示在亚-亚中的编号。
乙醇脱氢酶EC1.1.1.1 ，乳酸脱氢酶EC1.1.1.27 ， 苹果酸脱氢酶EC1.1.1.37 第一个数字表示大类： 氧化还原 第二个数字表示反应基团：醇基
第三个数字表示电子受体：NAD+或NADP+
第四个数字表示此酶底物：乙醇，乳酸，苹果酸。 ★P327 表8-9 酶的国际系统分类 ★氧、转、水、裂、异、合 氧化还原酶类 裂合酶类 转移酶类 异构酶类 水解酶类 连接酶类（也叫：合成酶） 42、酶的活力测定与分离纯化 1、 酶活力与酶促反应速度
酶活力：在一定条件下，酶催化某一反应的反应速度（一般测初速度）。
酶促反应速度：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。 单位：浓度/单位时间
研究酶促反应速度，以酶促反应的初速度为准(底物消耗≤5%）。
43、酶的活力单位（U）
国际单位（IU单位）： 在最适反应条件下，每分钟催化1μmol底物转化为产物所需的酶量，称一个国际单位（IU），1 IU = 1μmol /min
国际单位（Katal, Kat单位）：
在在最适反应条件下，每秒钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量，称Kat单位 1 Kat=60 × 106 IU
25℃或37 ℃）,最适pH、最适缓冲液离子强度、最适底物浓度。底物浓度（1）通常很大，使酶饱和（2）底物消耗≤5%一级反应V零级反应V[sucrose][enzyme]
44、酶的比活力 Specific activity
每毫克酶蛋白所具有的酶活力。单位：U/mg蛋白质。 酶的比活力是分析酶的含量与纯度的重要指标。
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45、酶分离和纯化 P338最下面的计算
大多数酶是蛋白质，因此酶的分离提纯方法，也就是常用来分离提纯蛋白质的方法。把酶制剂从很大体积浓缩到比较小的体积酶的提纯把酶制剂中大量的杂质蛋白和其他大分子物质分离出去判断分离提纯方法的优劣，两个指标来衡量总活力的回收——表示提纯过程中酶的损失情况比活力提高的倍数——表示提纯方法的有效程度应注意几点：
（1）选材——酶含量丰富的新鲜生物材料 ： 得材料后立即开始，否则应低温保存 （2）破碎（3）抽提——低温下，以水或低盐缓冲液，抽提 （4）分离及纯化——操作条件要温和，0～5℃下进行
4 步。步骤1 2 3 4总活力（U）6 4 3 2总蛋白质（mg）20 10 5 2比活力（U/mg）6/20 4/10 3/5 2/2酶的提纯过程中，总蛋白减少，总活力减少，比活力增高。酶的纯化倍数：每一步比活力第一步总活力1、米式方程：Michaelis和Menten13ESKESKPEK21913年VVmax*[S]Ks[S]Ks为底物解离常数（底物常数）×100%酶的回收率：每一步总活力第一步总活力Ksk2([E][ES])[S]k1[ES]）米式方程的导出：1、早年的米式方程基于快速平衡假说3ESK1ESKPEK2K413ESKESKPE2K的生成速度：K1（[E] -[ES]）[S]ES的分解速度：K2[ES]K1（[E] -[ES]）[S] = K2[ES][ES]①在反应的初始阶段，[S]远远大于[E]，因此，[S]可以认为不变。②因为研究的是初速度，P的量很小，由P+EES可以忽略不记。3ESK1ESKPEK2③游离的酶与底物形成ES的速度极快（快速平衡），而ES形成产物的速度极慢，故，[ES] 的动态平衡与ES P+E没有关系（既K1、K2＞＞K3）
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K1[E][S]K2K1[S]由于反应系统中[S]>>[E]，当[S]很高时所有的酶都被底物所饱和形成ES，即[E]=[ES]，酶促反应达到最大速率Vmax，则：Vmax=k3[ES]=k3[E]反应速度：VK3[ES]K3[E][S]K2[S]K1Vmax[S]KS[S]KS现在称为底物常数
、“稳态平衡假说”及其对米式方程的发展：Briggs和Haldane 192513ESKESKPEK2用稳态假说推导米式方程：13ESKESKPEK2生成速度：k1（[E] -[ES]）[S]ES分解速度：k2[ES]+k3[ES]以上两个速度相等：k1（[E] -[ES]）[S] = k2[ES]+k3[ES][ES]的动态平衡不仅与E+ S ES有关，还与ES P + E有关。稳态平衡假说的贡献在于发展了快速平衡学说的第③点。所谓―稳态‖：ES的形成速度与分解速度相等、ES的浓度保持不变的反应状态[ES][E][S][E][S]K2K3[S]Km[S]K1VK3[ES]K3[E][S]Vmax[S]Km[S]Km[S]（单体酶）Vmax[S]nVKm[S]nKmK2K3K1（寡聚酶）（米氏常数）Vmax=k3[E] 当Km及Vmax已知时，根据米氏方程可确定酶反应速度与底物浓度的关系。Vmax[S]Vmax[S]K’[S]Km[S]Km[S]《Km时V底物浓度低，酶没有全部被底物所饱和，因此在底物浓度低的条件下是不能正确测得酶活力的。当[S]》Km时VVmax[S]Vmax[S]VKm[S][S]max底物浓度远大于Km值时，反应速率已达到最大速率，这时酶全部被底物所饱和，v与[S]无关，符合零级动力学，只有在此条件下才能测得酶活力当[S]=Km时VVmax[S]VmaxKm[S]2底物浓度等于Km值时，反应速率为最大速率的一半。 26
米式方程中各参数的意义1、快速平衡假说与稳态平衡假说的实质区别13ESKESKPEK2当K1、K2》K3时，即ESP+E是整个反应平衡中极慢的一步：Vmax[S]Vmax[S]KmK2K3K12KKK1SVKm[S]KS[S]―稳态平衡= 快速平衡+ 慢速平衡‖：K2K3K2K3K1K1K1当ES P+E极慢（K3/K1极小）时，稳态平衡基本等于快速平衡★都是K3惹的祸、Km的物理意义当反应速度v=1/2 Vmax时，Km= [S]，Km的物理意义是：当反应速度达到最大反应速度一半时底物的浓度。单位：mol·L-1或mmol·L-1Km是酶的特征常数之一。一般只与酶的性质、底物种类及反应条件有关，与酶的浓度无关。P359 表9-1 一些酶的Km值。
Km最小的底物称该酶的最适底物或天然底物。因为：Km愈小（达到Vmax一半所需的底物浓度愈小）表示V对△[S] 越灵敏。V、Km与天然底物、Km、Ks与底物亲和力KmK2K3K2K3K3KsK1K1K1K1★Km是ES分解速度（K2+K3）与形成速度（K1）的比值，它包含ES解离趋势（K2／K1）和产物形成趋势（K3／K1）。★Ks是底物常数，只反映ES解离趋势（底物亲和力），1/Ks可以准确表示酶与底物的亲和力大小。1/2VmaxKm[S]★只有当K1 、K2》K3时，Km≈Ks，因此，1/Km只能近似地表示底物亲和力的大小。★底物亲和力大不一定反应速度大（反应速度更多地与产物形成趋势K3／K1有关）27
、Km与米式方程的实际用途（1）根据[S]求VV[S]naVmaxKm[S]n（2）根据V（或相对速度a）求[S][S]aaKm1a（单体酶）（寡聚酶）设定达到最大反应速度的0.9倍时，所需底物浓度为[S]0.9
[S]0.9=9Km 同理有：[S]0.8=4Km
[S]0.7=2.33Km [S]0.6=1.5Km [S]0.5=1Km [S]0.1=1/9Km
[S]0.9 /[S]0.1=81 [S]0.7/[S]0.1=21
[S]anaKm1a（3）根据相对速度推测酶活性中心饱和度Y：V[S]YaVmaxKm[S][S]YKm1Y当v=Vmax时，表明酶的活性部位已全部被底物占据，v与[S]无关，只和[E0]成正比。（[S] >>Km）当v=1/2 Vmax时，表示活性部位有一半被占据。
（4）根据Km推测代谢的方向及程度
★根据正逆反应Km的差别及细胞内正逆两相底物的浓度推测酶促反应的正逆方向。 ★根据代谢途径中各个酶的Km及其相应底物浓度判断限速步骤（ Km最大的步骤不一定是限速步骤）
★根据Km值的大小判断分支代谢的流向 ★酶工程与代谢工程中改造酶的Km调控代谢途径（强化则降低Km，弱化则提升Km ）
6、 Vmax与K3（ Kcat）的意义
在一定的酶浓度下，Vmax是一个常数，它只与底物的种类及反应条件有关。 当[S]很大时，Vmax=K3 [E]
K3代表酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，称为转换数（或催化常数，Kcat）， 表明酶的最大催化效率 P322表8-2一些酶的最大转换数 转换数的倒数即为催化周期：一个酶分子每催化一个底物分子所需的时间。 乳糖脱氢酶转换数为1000/秒，则它的催化周期为10-3秒
、Kcat/Kmrepresents actual catalytic efficiency becausein vivo [S]/Km=0.01-1.0vVmax[S]Kcat[E][S]Km[S]Km[S]vKcatKm[E][S][S]< 只有Kcat/Km可以客观地比较不同的酶或同一种酶催化不同底物的催化效率 Km和Vmax的求解方法选底物浓度应考虑能否得到1/[S]的常数增 1、Lineweaver-Burk双倒数作图法量： Vmax[S]V[S]为1.01、1.11、1.25、1.42、1.66、2.0、Km[S]2.5、3.33、5.0、10时 1Km111/[S]为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、VVmax[S]Vmax1/V0.8、0.9、1.0是常数增量。 斜率[S]为常数增量1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10=Km/Vmax时， 1/Vmax1/[S]为0.1、0.111、0.125、0.5、1.0，是非 1/Km常数增量，点多集中在1/v轴附近。 1/[S]抑制剂对酶促反应速度的影响 变性作用(denaturation)： 抑制作用(inhibiton)：使酶活力下降或丧失1、相对活力但并不引起酶蛋白变性 V★相对活力分ai变性剂没有选择性 V0数抑制剂有不同程度的选择性 ★相对活力百分数研究抑制剂对酶的作用有重大的意义： 2、抑制率（1）药物作用机理和抑制剂型药物的设计 （2）了解生物体的代谢途径，进行人为调 VVVi1a1i0i★抑制分数控或代谢控制发酵 V0V0（3）通过抑制剂试验研究酶活性中心的构 象及其化学功能基团，不仅可以设计★抑制百分数药物，而且也是酶工程和化学修饰酶、酶工业的基础 46、抑制作用的类型 1、不可逆的抑制作用 抑制剂与酶活性中心（外）的必需基团共价结合，使酶的活性下降，无法用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使 酶复活。 2、 可逆的抑制作用 抑制剂与酶蛋白非共价键结合，可以用透折、超滤等物理方法除去抑制剂而使 酶复活。 （1）竞争性抑制（Competitive inhibition） 抑制剂具有与底物类似的结构，竞争酶的活性中心，并与酶形成可逆的EI复合物，阻止底物与酶结合。 EI不能分解成产物P，酶反应速率下降。 可以通过增加底物浓度而解除此种抑制。 P369 结构式 丙二酸、戊二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制 （2）非竞争性抑制 底物和抑制剂可以同时与酶结合，但是，中间的三元复合物ESI不能进一步分解为产物，因此，酶的活性降低。 抑制剂与酶活性中的以外的基团结合，其结构可能与底物无关。 不能通过增加底物的浓度的办法来消除非竞争性抑制作用 29 某些重金属离子对酶的抑制属于非竞争性抑制：Cu2+、Hg2+、Pb2+ （3）、反竞争性抑制 酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合。E+S→ES+I →ESI≠ P 常见于多底物的酶促反应中 1、不可逆抑制剂： （1）、 非专一性不可逆抑制剂 与酶的活性中心以及活性中心外的某一类或几类必需基团反应 ①、 有机磷的酰化物 二异丙基磷酰氟（DFP，神经毒气）和许多有机磷农药。 Ｐ374 结构式：磷酰化剂与DFP P374 反应式：磷酰化剂与胆碱酯酶形成磷酰化胆碱酯酶 抑制机理：与蛋白酶及酯酶活性中心Ser的—OH形成磷脂键。 毒理：强烈抑制乙酰胆碱脂酶（神经毒剂）。 解毒剂：PAM（解磷定）可以把酶上的磷酰基团除去。 ②、有机汞、有机砷化合物 抑制机理：使酶的巯基烷化 P375 ：对氯汞苯甲酸（PCMB）与巯基酶的反应 毒理：主要与还原型硫辛酸辅酶反应，抑制丙酮酸氧化酶系统。 解毒剂：二巯基丙醇（BAL）、Cys、GSH等过量的巯基化合物。 ③重金属 ： Ag、Cu、Hg、Cd、Pb能使大多数酶失活，EDTA可解除。 ④、烷化物 ★含卤素的烷化物（碘乙酸、碘乙酰胺、卤乙酰苯等）常用于鉴定酶中巯基。 ⑤氰化物、硫化物、CO ： 与含铁卟啉的酶中的Fe2+结合，阻抑细胞呼吸 ⑥、青霉素： 不可逆抑制糖肽转肽酶 ⑦、还原剂 巯基乙醇、二硫苏糖醇等巯基试剂还原酶的二硫键⑦、含活泼双键试剂（与—ＳＨ、—ＮＨ２反应） Ｎ—乙基顺丁烯二酰亚胺 图 ⑧亲电试剂 ： 四硝基甲烷，可使Tyr硝基化。 图 （2） 专一性不可逆抑制剂 ：此类抑制剂仅仅和某一种酶的活性部位的必需基团反应。 ①、 Ks型不可逆抑制剂（亲和标记试剂，亲合修饰试剂）（affinity labeling reagent) 具有与底物相似的结构，同时还带有一个能与酶活性中心或活性中心外的必需基团进行化学反应的活泼基团。 专一性程度取决于它与活性中心及活性中心外的的Ks之比 P376 图9-25 胰蛋白酶的底物及其Ks型不可逆抑制剂 胰乳蛋白酶的最佳底物：对-甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲酯 Ks型不可逆抑制剂：对一甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲烷（TPCK） -CH2-cl与酶活性部位的一个His-咪唑基距离很近，很易使之烷基化。 ②、 Kcat型不可逆抑制剂（自杀性底物, suicide substrate） 具有与底物相似的结构，不仅能与酶结合，而且潜伏的反应基团（latent reactive group）能被酶催化而活化，并与酶活性中心必需基团进行不可逆结合 30 P376 图 9-26 β -氯代-D-Ala抑制丙氨酸消旋酶的机制 2、 可逆抑制剂 ★竞争性抑制剂（Competitive inhibition） 许多代谢类似物都是竞争性抑制剂，可用作抗菌药和抗癌药物 ★抗癌药 : 氨基叶酸、阿拉伯糖胞苷、5-氟尿嘧啶等。 ★抑制剂与药物开发 Kcat型不可逆抑制剂的专一性程度很强，前景广阔 底物类似物型的竞争性抑制剂最易开发 过度态底物类似物型药物最具价值(高效\\特异) 47、 酶的活性中心（少酶活性部位） 1、活性中心的概念 活性中心：酶分子中结合底物并起催化作用的少数氨基酸残基，包括底物结合部位、催化部位 频率最高的活性中心的氨基酸残基：Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。 不需要辅酶的酶：活性中心是酶分子在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基的某些基团。 需要辅酶的酶：辅酶分子或辅酶分子的某一部分结构往往就是活性中心的组成部分。 2、 活性中心的结构特点：P384 接触残基：R1、R2、R6、R8、R9、R163 结合残基辅助残基：R3、R4、R5、R164、R165 接触残基结构残基：R10、R162、R169 催化基团活性中心非贡献残基：其它 辅助残基必需残基活性中心外非必需残基结构残基 （1）接触残基： 结合基团，催化基团。 （2）辅助残基：不与底物接触，辅助酶与底物结合，协助接触残基 上述两类残基构成酶活性中心。 （3）结构残基 维持酶分子三维构象，与酶活性相关，但不在酶活性中心范围内，属于酶活性中心以外的必需残基 上述三类残基统称酶的必需基团 （4）非贡献残基（非必需基团） 可能在免疫，酶活性调节，运输转移，防止降解等方面起作用。 4、 活性中心的一级结构与分子进化 一些酶的活性中心一级结构结构与催化机理相似，可把它们归为一族。 蛋白水解酶： （1）丝氨酸蛋白酶家族（胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶等） （2）锌蛋白酶家族（羧肽酶等）（3）巯基蛋白酶家族（木瓜蛋白酶等） （4）羧基蛋白酶家族（胃蛋白酶等） 31 丝氨酸蛋白酶族活性中心： 胰蛋白酶（牛） Asp-Ser-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Ser-Gly-Lys 胰凝乳蛋白酶（牛） Ser-Ser-Cys-Met-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-Val-Cys-Lys- Lys-Asn 弹性蛋白酶（猪） Ser-Gly-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-His-Cys-Leu-Val-Asn 凝血酶（牛） …Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro 这4个源于哺乳动物的酶活性中心，都含有一个包括Ser在内的完全相同的六肽： Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro 同源的趋异进化 来自胰脏的胰蛋白酶（Lys、Arg ）、胰凝乳蛋白酶（Phe、 Tyr、 Trp、）和弹性蛋白酶（疏水残基），活性中心Ser附近的a.a顺序相同，且分子一级结构中有40%a.a顺序相同，三维结构也相同，表明它们起源于共同的祖先，但是它们的底物专一性不同。 ★来源于共同祖先，经基因突变而得出不同专一性的结果称为同源的趋异进化。 异源的趋同进化 丝氨酸蛋白酶族活性中心： 枯草杆菌Ser蛋白酶： -Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Ser 胰脏的胰凝乳蛋白酶等：Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro 电荷中继网： 枯草杆菌蛋白酶： Asp32-His64-Ser221 胰凝乳蛋白酶： Asp102-His57-Ser195 ★来源不同，功能特征相同，称异源的趋同进化。 48、酶催化反应的独特性质（专一性的机理 ） P332 （一） 酶专一性类型 1、 结构专一性 （1）、相对专一性 ★键专一性（对底物结构要求最低）★基团专一性Group Specificity 不仅对键有要求，还对键一端的基团有要求，但对另一端基团要求不严格。 α—D—Glc苷酶，水解蔗糖和麦芽糖。 （2）、 绝对专一性 只能作用于一个底物，或只催化一个反应。麦芽糖酶只作用于麦芽糖，脲酶只催化尿素水解。 2、 立体异构专一性 （1）、 旋光异构专一性（2）、 几何异构专一性 反丁烯二酸水化酶只催化反丁烯二酸生成苹果酸 立体化学专一性还表现在酶能区分从有机化学观点看属于对称分子中的两个等同的基团，并只催化其中一个，而对另一个无作用。 a. 甘油激酶只催化甘油中的一个CH2OH磷酸化。 b. 顺-乌头酸酶只作用于柠檬酸的两个-CH2COOH中的一个。 立体专一性在实践中的应用： 药物的不对称合成或不对称拆分。 用乙酰化酶制备L—氨基酸 （二） 酶作用专一性的解释 1、锁钥模型(lock-key hypothesis) 酶活性中心的形状与底物分子形状互补。 底物分子或其一部分像钥匙一样，专一地插入酶活性中心，通过多个结合位点的结合，形成酶—底物复合物。 酶活性中心的催化基团正好对准底物的有关敏感键，进行催化反应。P334、图8-5 锁钥模 32 型较好地解释了立体异构专一性。但不能解释可逆反应。 2.诱导楔合模型(induced-fit hypothesis) 酶分子与底物分子接近时，酶蛋白质受底物分子诱导，构象发生有利于与底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补楔合，进行反应。 三、 高效性的机理 1、邻近效应与定向效应变分子间反应为分子内反应 邻近效应：酶与底物形成中间复合物后使底物之间、酶的催化基团与底物之间相互靠近，提高了反应基团的有效浓度。 定向效应：由于酶的构象作用，底物的反应基团之间、酶与底物的反应基团之间正确取向的效应 酶把底物分子从溶液中富集出来，使它们固定在活性中心附近，反应基团相互邻近，同时使反应基团的分子轨道以正确方位相互交叠，反应易于发生。 邻近效应与定向效应对反应速度的影响： ①使底物浓度在活性中心附近很高 ②酶对底物分子的电子轨道具有导向作用 ③酶使分子间反应转变成分子内反应 ④邻近效应和定向效应对底物起固定作用 2、底物形变和诱导契合的催化效应 酶中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电子云密度变化，产生电子张力，降低了底物的活化能 ①酶从低活性形式转变为高活性形式，利于催化。②底物形变，利于形成ES复合物。 ③底物构象变化，过度态结构，大大降低活化能。 3、 酸碱催化 酶分子的一些功能基团起瞬时质子供体或质子受体的作用。 P391 表4-14 酶分子中可作为广义酸碱的功能基团 影响酸碱催化反应速度的两个因素 ⑴酸碱强度(pK值）。组氨酸咪唑基的解离常数为6，在pH6附近给出质子和结合质子能力相同，是最活泼的催化基团。 ⑵给出质子或结合质子的速度。咪唑基最快，半寿期小于10-10秒 4、 共价催化 酶作为亲核基团或亲电基团，与底物形成一个反应活性很高的共价中间物。 P392 表10-5 形成共价ES复合物的某些酶 酶亲核基团：Ser-OH，Cys-SH，His-N： 底物亲电中心：磷酰基（-P=O），酰基（-C=O），糖基（Glu-C-OH） 5、活性中心金属离子的催化作用 金属酶（metalloenzyme):Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co3+ 金属-激活酶（metal-activated enzyme):Na+、K+、Mg2+、Ca2+ （1）通过结合底物为反应定向（2）通过自身价数的改变参加氧化还原反应 （3）屏蔽底物或酶活性中心的负电荷 6、 活性中心的微环境 ⑴ 疏水环境：介电常数低，加强极性基团间的作用。 ⑵电荷环境：在酶活性中心附近，往往有一电荷离子，可稳定过渡态的离子 某些酶的活性中心及其作用机理 （一）、 丝氨酸蛋白酶的作用机理： 胰蛋白酶(trypsin) 弹性蛋白酶（elastase) 胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin) 凝血酶（thrombin) 33 枯草杆菌蛋白酶（subtilisin) 组织纤溶酶原激活剂 纤溶酶（plasmin) 乙酰胆碱酯酶（acytalcholinesterase) 1、丝氨酸蛋白酶家族的底物专一性 ★丝氨酸蛋白酶家族具有类似的Ser -His-Asp催化三联体（电荷中继网）。 P407 图10-34 胰凝乳蛋白酶的催化三联体 电荷中继网： Ser195—His57—Asp102氢键体系。通过电荷中继网进行酸碱催化及共价催化。 P409图10-40在胰凝乳蛋白酶中催化三联体的作用 但它们活性中心的底物结合部位不同，底物专一性也不同。 ★丝氨酸蛋白酶的活性中心位于酶分子表面凹陷的小口袋中，口袋的大小以及口袋内的微环境（疏水性、电荷性质）决定了丝氨酸蛋白酶的底物专一性 P408 图10-35 胰脏中的三种蛋白酶的底物结合部位 49、胰凝乳蛋白酶 ： 口袋较大，主要由疏水氨基酸残基围成，开口较大（由两个Gly组成），因此需要底物有一个疏水基团（芳香环Phe、Tyr、Trp及大的非极性侧链）定位。裂解芳香族氨基酸羧基侧的肽键 胰蛋白酶： 口袋较大，底部有Asp，利于 Lys.、Arg结合，裂解碱性氨基酸残基羧基侧的肽键 弹性蛋白酶： 口袋较浅，开口较小（由Val，Thr组成）只能让Ala等小分进入，裂解小的中性氨基酸残基羧基侧的肽键 2、胰凝乳蛋白酶的动力学研究 P408 图10-36 研究胰凝乳蛋白酶作用机制的人工底物 P408 图10-37 胰凝乳蛋白酶的动力学曲线 （1）（乙）酰化阶段：（2）脱（乙）酰化阶段 P408 图10-38 3、胰凝乳蛋白酶的催化机制 ★丝氨酸蛋白酶家族具有类似的Ser -His-Asp催化三联体（电荷中继网）。 P407 图10-34 胰凝乳蛋白酶的催化三联体 34 电荷中继网： Ser195—His57—Asp102氢键体系。通过电荷中继网进行酸碱催化及共价催化。 P409图10-40在胰凝乳蛋白酶中催化三联体的作用 没有底物时， Ser195—His57—Asp102形成一个氢键体系，His57是去质子化状态， Asp102的COO-通过氢键定位并固定His57。 结合底物时： His57从Ser195接受一个质子，增加了Ser195羟基氧原子对底物的亲核攻击性， Asp102的COO-稳定过度态中His57的正电荷形式。 ★ P410图10-42 胰凝乳蛋白酶反应的详细机制 第一阶段： 酰化 Ser195--OH 中的氧攻击肽键的羰基碳（共价催化），酶的His57咪唑H+与底物中的-NH形成氢键（酸碱催化），形成四联体过渡态（Ser195—O-、底物的羰基C、底物的-NH、His的咪唑H+ ），肽键断裂，氨基产物释放，底物的羧基部分酯化到Ser195的羟基上。 第二阶段： 脱酰 电荷中继网从水中吸收一个质子，结果产生的OH-攻击连在Ser195上底物的羰基C原子，形成四联体过渡态，然后His57供出一个质子给Ser195上的氧原子，底物中的酸成分从Ser195上释放。 50、别构调控 调节物（效应物）与别构酶分子中的别构中心（调节中心）非共价结合后，诱导或稳定了酶分子的某种构象，从而调节酶活性中心对底物的结合。 1、天冬氨酸转氨甲酰酶—正协同效应的别构酶（aspartate transcarbamylase ,ATCase） P413 ATCase催化的反应 底物氨甲酰磷酸和天冬氨酸的结合是正协同的 P414 图10-46 ATCase的别构效应 CTP终产物反馈抑制：降低酶与底物的亲和力，不改变Vmax ATP激活：增加酶与底物的亲和力，不改变Vmax 2、 3-磷酸甘油醛脱氢酶—负协同效应的别构酶 P418 反应式 4个亚基，理论上可以结合4个NAD+，但从第三个亚基开始，解离常数迅速增大， P418表10-8磷酸甘油醛脱氢酶与NAD+结合的解离常数 因此，每个酶只能结合2分子的NAD+， 半位反应性（half site reactivity)— 极端的负协同效应 51、 别构酶的结构特点和性质 、别构酶的动力学曲线（1） 已知的别构酶都是寡聚酶，通过次级 键结合 Vmax[S]n（2）具有活性中心和别构中心（调节中心）， V活性中心和别构中心处在不同的亚基Km[S]n上或同一亚基的不同部位上。 （3）多数别构酶不止一个活性中心，活性 中心间有同位效应，底物就是调节物：an[S]Km有的别构酶不止一个别构中心，可以a1a接受不同的代谢物的调节。 （4）不遵循米式方程，动力学曲线是S型 一般用K0.5或[S]0.5代替Km（正协同效应）或表观双曲线（负协同 效应）。 P419 图10-57正、负协同别构酶与米式酶的动力学曲线 35 P419 图10-57正、负协同别构酶与米式酶的动力学曲线 ① 同位效应为正协同效应的别构酶是S型曲线 当底物浓度发生较小变化时，别构酶可以极大程度地控制反应速度。 米氏酶：[S]0.9/[S]0.1=81 别构酶（n=4）：[S]0.9/[S]0.1=3 表明表明反应速度对底物浓度的变化敏感 ，当底物浓度发生较小变化时，如上升3倍，别构酶的酶促反应速度可以从0.1Vmax升至0.9Vmax 。 ② 同位效应为负协同效应的别构酶是表观双曲线 表明反应速度对底物浓度的变化不敏感 ③调节物的别构效应 当增加正调节物浓度时，Km减小，亲和力增大，协同性减小（对底物浓度的反应灵敏度降低） 。 当增加负调节物的浓度时，Km增加，亲和力减小，协同性增大（对底物浓度的反应灵敏度增加）。 P414 图10-46 ④ K型效应物与V型效应物 P419 图10-58 10.95、 别构酶的鉴定 (Km)n1Y0.90.1Rs81n ① 双倒数作图不是直线 1Y0.10.1 ②协同指数法（cooperativity index , Ci) (Km)n0.9 饱和比值（saturation ratio, Rs) 米氏酶：Rs=81 正协同：Rs＜81，越小，正协同性越大 负协同：Rs＞81 ，越大，负协同性越大 ③ Hill系数法 米氏酶：n=1 正协同： n＞1 ，越大，正协同性越大 负协同： n＜1 ，越小，负协同性越大 ④ 脱敏作用： 理化处理后，仍保持活性，但失去调节性质。脱敏后的别构酶表现为米式酶的动力学曲线 6、别构酶调节活性的机理 ① 序变模型： 酶分子中亚基结合底物后，构象逐个地依次变化。 ② 齐变模型： 36 52、 酶原的激活 具有不可逆性。 消化系统中的酶（胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶） 血液凝固系统中的酶。 1、消化系统蛋白酶原的激活 （1）、胰凝乳蛋白酶原的激活（由胰蛋白酶激活）P422 图10-62胰凝乳蛋白酶原的激活 （2）胃蛋白酶原的自动激活 pH＜5时，活性中心暴露，切除N端的44个残基的碱性肽段。 （3）胰蛋白酶原的激活：Ca2+、肠激酶催化 P423图10-64胰蛋白酶原的激活 （4）、 胰蛋白酶对胰脏蛋白酶原的激活 37 53、蛋白激酶 根据底物蛋白质被磷酸化的氨基酸残基种类，可分为： （1）Ser/Thr型（2）Tyr型 根据它们是否有调节物来分： （1）非信使依赖型（2）信使依赖型： 胞内信使依赖型：PKA、PKG、PKC等 激素或生长因子依赖型（受体型激酶）：PTK等 几种重要的蛋白激酶 （1） PKA（2）PKC（3）磷酸化酶激酶（PhK）（4）蛋白酪氨酸激酶（PTK） 54、蛋白质的性质与分离、纯化、鉴定 一、 蛋白质的酸碱性质和等电点 ★ 等电点 ★等离子点：中性盐（Ca2+、Mg2+、cl、HPO42++）影响滴定曲线形状和等电点。 盐离子浓度为0时的等电点称等离子点 ★等电点测定：溶解度法、聚焦电泳法 55、 蛋白质的大小与形状 测分子量的方法： ★化学组成法测定最低分子量 ★渗透压法 ★SDS-PAGE法 ★扩散系数法 ★凝胶过滤法 ★沉降系数法和沉降平衡法 1.根据分子组成测定最小分子量 如肌红蛋白含0.335%的铁 Fe分子量 55.8 最小M＝ Fe(%) = 0.335 =16700 牛血清白蛋白含Trp0.58% 最低M=35200，实际为69000，含2个Trp 2、 葡聚糖凝胶过滤法分析蛋白质分子量 p297-298 据pr的渗透压p292用一半透膜将pr溶液与纯水隔开，当渗透达平衡时，测定其渗透压，计算分子量：MrRTlimc0cC：浓度（克/升）R：气体常数（0.082升/大气压/克分子/K开氏温度）T：绝对温度（开氏温度）：以大气压表示的渗透压 38 4.SDS—PAGE （十二烷基硫酸钠—— 聚丙烯酰胺凝胶电泳） 三、 蛋白质的胶体性质与选择性沉淀 p299 蛋白质分子直径在1-100nm之间，在水溶液中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达耳现象，不能通过半透膜） 1、 稳定蛋白质胶体溶液的主要因素 ①蛋白质表面极性基团形成的水化膜②非等电状态时，同种电荷的互相排斥。 ③质点大小在1-100nm，可以进行布郎运动 2、 选择性沉淀蛋白质的方法 P300 ①盐析法: 大量的中性盐[（NH4）2SO4、Na2SO4、Nacl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。 ②有机溶剂沉淀法： 破坏水化膜，降低介电常数，PEG、丙酮、乙醇等 ③重金属盐沉淀：pH＞pI时带负电荷，与重金属离子（Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等）结成不溶性沉淀 ④生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH小于等电时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。 生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、钨酸。 酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸。 ⑤加热变性沉淀。 ⑥等电点沉淀法 六、 分离纯化蛋白质的主要方法 P301 ★根据蛋白质的溶解度分离 ★根据配体特性异性分离（亲和层析） ★根据电荷差异分离 ★选择性吸附分离（物理吸附） ★根据分子大小分离 ★根据疏水性的差异 （一）根据溶解度差异的分离：选择性沉淀法 P304-307 盐析法 负电荷） PEG沉淀法 生物碱和酸选择性沉淀法（pH《pI，蛋白质有机溶剂沉淀法 带正电荷） 等电点沉淀法 热处理沉淀法（铜锌SOD，65℃、15分钟、重金属盐选择性沉淀法（pH》pI，蛋白质带稳定1、等电点沉淀 P305 在等电点条件下，蛋白质的电导性、溶解度最小，粘度最大。 在pI时，分子电荷为零，蛋白质分子间的静电排斥消失，从而蛋白质出现聚集沉淀。 2、蛋白质的盐溶与盐析 P305 盐溶：低盐浓度时，蛋白质溶解度↑，称盐溶。 盐析：高盐浓度时，使pr溶解度↓析出，称盐析。 盐析多用溶解度大的中性盐，如(NH4)2SO4、NaCl、MgCl2、NH4Cl、KCl等的饱和溶液 二）、根据 分子大小和形状的差异：P301-304 ①透析和超滤法：除去小分子物质 P210 图3-108透析、3-109超滤 ②密度梯度离心法 P211 图3-110 蔗糖密度剃度离心 ③凝胶过滤法 P212 图3-111凝胶过滤层析的原理 半透膜阻留pr分子，而让小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。 39 施以一定的压力使小分子溶质通过一半透膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋白质分子 沉降的速度与颗粒的重量、密度和形状有关。离心后按其沉降的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰冻切片采样分析 蔗糖密度剃度 聚蔗糖密度剃度 Vt=Vo+Vi洗脱体积Ve=Vo+kd·Vi①当kd=0时，Ve=Vo，溶质全从Vo出来，无分配。②当kd=1时，Ve=Vo+Vi，溶质全进筛子，各物质尽管有分配，但各物质不能分开。③当0〈kd〈1时，Ve=Vo+kd·Vi,各溶质具不同分配，得以分离。（三） 根据电荷性质的差异: P307-312 1、电泳和等电聚焦法： 普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管电泳 从电泳结果分：自由界面电泳、区带电泳、盘状电泳 从装置上分：圆盘电泳（柱状）、水平板电泳、垂直板电泳。 从支持物分： 自由界面电泳、纸电泳（或薄膜电泳）、凝胶电泳（PAGE ，琼脂糖胶，淀粉胶等） 2、离子交换层析法：P310 离子交换纤维素： 离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应 离子交换交联琼脂糖：P 310 表7-6 40 一些常用的纤维素离子交换剂和sephadex离子交换剂 （四）根据选择性吸附的差异：吸附层析法 极性：硅胶、氧化铝、岩藻土（离子吸引和氢键） 非极性：活性炭（范德华力、疏水作用） 最广泛最有效：羟基磷灰石（hydroxyapatite)，即结晶磷酸钙[Ca10（PO4）6（OH）2]，可分离蛋白质、核酸，与DNA的亲和力最高 （五）根据疏水性的差异： 疏水层析和反相HPLC 1、疏水层析 层析介质：苯基琼脂糖（phenyl-sephadex) 辛基琼脂糖(octa-sephadex) 洗脱： 低盐高PH 非离子型去污剂（triton x-100) 脂肪醇（丁醇、乙二醇） 2、反相HPLC P314 固定相：丁基硅烷、辛基硅烷、C18硅烷 （六） 配体亲和力的差异 ： 亲和层析 配基： 酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结构类似物，激素与受体蛋白，抗原与抗体，生物素与亲和素（抗亲和素蛋白），凝集素。 免疫亲和层析、凝集素亲和层析、金属螯和层析、染料配体层析 七、蛋白制品的含量分析、纯度鉴定与活性分析 （一）、含量分析 总蛋白含量分析：凯氏定氮法、Folin-酚法（Lowry法）、双缩脲法、考马斯亮蓝法、紫外吸收法 特定蛋白组分的含量分析： 酶和激素等：酶活性或激素活性表示（比活性） 其它蛋白：抗原抗体反应(western blot) （二）纯度鉴定（均一性） 基本手段：电泳分析：单条带。 N端测定：n亚基蛋白有1-n个N端aa。 选用手段：沉降分析、溶解度分析（P224）、 结晶分析（能结晶的一般比较纯，具有活性） 其它鉴定工作： （ 一）分子量的测定 （二）等电点测定 （三）N-末端AA测定 （四）C-末端AA的测定（肼解法） （五）分子中糖链 ①血球凝集反应；②糖蛋白电泳（甲苯胺兰、R山兰、schiff试剂）； ③糖组分分析（层析、液相色谱） (六）含脂成分：苏丹黑预染、电泳。 (七）光吸收 全波长扫描。找出它的吸收峰位置和最大吸则。 （八）AA组分分析 41 56、单糖的结构 1、 单糖的链状结构 确定链状结构的方法（葡萄糖）： a. 与Fehling试剂或其它醛试剂反应，含有醛基。 b. 与乙酸酐反应，产生具有五个乙酰基的衍生物。 c. 用钠、汞剂作用，生成山梨醇。 链状结构用Fisher投影式表示：碳骨架、竖直写；氧化程度最高的碳原子在上方 左旋异构体(levorotary,L)或L型异构体。 右旋型异构体(dextrorotary)，或D型异构体。 2、 单糖的环状结构 • Haworth结构式： ① 画一个五元或六元环 ② 从氧原子右侧的异头碳(anomeric carbon)开始，画上半缩醛羟基，在Fischer投影式中右侧的居环下，左侧居环上。 构象式：最能正确地反映糖的环状结构——折叠形结构。 呋喃吡喃D-果糖α－D－呋喃果糖β－D－呋喃果糖α－D－吡喃葡糖β－D－吡喃葡糖3、 几种重要的单糖的链状和环状结构式 (1) 丙糖：D-甘油醛 二羟丙酮 (2) 丁糖：D-赤鲜糖 D-赤鲜酮糖 (3) 戊糖：D-核糖 D-脱氧核糖 D-核酮糖 (4) 己糖：D-葡萄糖(-型及型) D-果糖 (5) 庚糖：D-景天庚酮糖 甘油醛（醛糖）二羟丙酮（酮糖） 42 葡萄糖（醛糖）果糖（酮糖）核糖（戊醛糖）脱氧核糖（戊酮糖）D－甘油醛D－赤藓糖D－苏糖D－核糖D－阿拉伯糖D－木糖D－来苏糖D－阿洛糖D－阿桌糖D－葡萄糖D－甘露糖D－古洛糖D－艾杜糖D－半乳糖D－塔罗堂（D系醛糖）p7 43 因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容