亚硝酸还原酶的分离纯化及其性质研究

2011No．9SerialNo．234

ChinaBrewing

ResearchReport

亚硝酸还原酶的分离纯化及其性质研究

刘

萍，罗

岩，张

莹，杨艳，孙君社，倪元颖

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

摘要：经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Cellulose柱层析、SephadexG-75凝胶过滤层析，由巨大芽孢杆菌（B.megateriumMPF-906）分离纯

化得到亚硝酸还原酶（nitritereductase,NiR），分子量为35ku。NiR反应的最适温度和pH值分别为40℃和6.5。热稳定性较好，80℃保温4h后仍有50%的酶活力。在pH5.5～9.0均较稳定，残余酶活都在60%以上。Cu2+、Ba2+能提高酶活力；Mn2+、Pb2+对酶活力有明显抑制作用；Na+、Fe3+、Mg2+、Al3+对其有轻微抑制作用；Ca2+、Zn2+对酶活力影响不大。亚硝酸钠为底物，该酶的Km=8.6mmol/L，Vmax=4.1U/mg，该酶的适电子供体为抗坏血酸20mol/L、0.1mol/L的连二亚硫酸钠和0.075mol/L的草酸钠。关键

词：巨大芽孢杆菌；亚硝酸还原酶；分离纯化；酶学性质

文献标识码：A

文章编号：0254-5071（2011）09-0022-05

中图分类号：Q554

Isolation,purificationandpropertiesofnitritereductasefromBacillusmegateriumMPF-906LIUPing,LUOYan,ZHANGYing,YANGYan,SUNJunshe,NIYuanying

(CollegeofFoodScienceandNutritionalEngineering,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100083,China)Abstract：Thenitritereductase(NiR)fromBacillusmegateriumMPF-906wasisolatedandpurifiedbyammoniumsulfatesalting-out,DEAE-cellu-losecolumnchromatographyandSephadexG-75gelfiltration,andthemolecularweightwas35ku.TheoptimaltemperatureandpHvalueforen-zymereactionwere40℃and6.5,respectively.Theenzymehasgoodthermalstability,whichremainedabout50%enzymeactivityaftertreatmentat80℃for4h.ItwasinstablestatewhenpHvalueinbetweenof5.5and9.0andtheactivityofresidualenzymewasabove60%.Besides,activityofNiRwasstronglyinhibitedbyMn2+,Pb2+andmoderatelyinhibitedbyNa+,Fe3+,Mg2+,Al3+,whileCa2+,Zn2+hadnoevidenteffects.ItsKmandVmaxwere8.6mmol/Land4.1U/mg,respectivelywhenusingsodiumnitriteassubstrate,andtheoptimalelectronicdonorwas20mmol/Lascorbicacid,0.1mol/Lsodiumhydrosulfiteand0.075mol/Lsodiumoxalate.Keywords：Bacillusmegaterium;nitritereductase;isolationandpurification;enzymeproperties

亚硝酸钠作为国家食品卫生法允许使用的食品添加剂，在肉制品加工中被广泛使用。然而亚硝酸盐残留过高对人有极大危害，食品中亚硝酸盐含量一直是食物安全性的焦点之一。世界上许多国家呼吁严格控制亚硝酸或硝酸盐使用量，目前国内外都在研究一种既能使香肠色泽鲜艳持久，保鲜性能好，又能降低和消除亚硝酸盐残留量的香肠生产方法，但迄今还未有一种理想的生产方法[1]。降低肉制品中亚硝酸盐含量的方法主要有化学方法和生物方法。化学方法主要集中在利用发色剂或防腐剂等替代物减少亚硝酸盐的添加量，但不能完全替代亚硝酸盐的应用，对最终亚硝酸盐的残留量不能控制[2]。生物方法主要是利产生的亚用微生物作为发酵剂降低肉制品中的pH值[3-6]、硝酸还原酶（NiR）来降解肉制品中的亚硝酸盐[7-9]，能够使肉制品中亚硝酸盐的残留量控制在较低的水平，但目前生物方法的研究和应用主要集中在发酵香肠中利用微生物降低亚硝酸盐残留量，而对于肉制品加工过程中添加NiR酶制剂来控制品质和亚硝酸盐残留量方面还较少有人研究，主要是由于还未获得适用于肉制品高温、高盐等加工条件且可工业化生产的NiR酶制剂[10]。

NiR是催化亚硝酸盐还原为一氧化氮（NO）的酶[11]。在

收稿日期：2011-05-28

肉制品加工过程中添加亚硝酸盐的目的是使其产生NO，NO再与肉中的高铁肌红蛋白在加热条件下生成呈色物质。因此，若能在肉制品加工过程中将NiR作为酶制剂加入，一方面将加快NO的产量和速率，减少了亚硝酸盐的添加量；另一方面该酶会将残留的亚硝酸盐全部催化为NO，这样不但能获得色泽鲜艳、保鲜性能好的肉制品，而且将极大地降低肉制品中亚硝酸盐的残留，甚至可获得无亚硝酸盐残留肉制品。国外有研究将NiR直接加入香肠中以降解残留的亚硝酸盐，但由于所获得的酶类不能耐受高温，不能完成在香肠加工快速升温过程中酶解过程。一般的酶

12]

制剂在该条件下已完全失活[10，。因此，若能够获得在加

热后还具有酶活性的NiR，将对于利用生物法降低亚硝酸盐残留量起到重要作用。本研究通过筛选获得的巨大芽胞杆菌生产的NiR具有耐高温的特点，为该酶的肉制品中的降低亚硝酸盐的残留量提供了一种安全、不影响生色的新方法。不同电子供体对NiR酶活有显著影响[13-14]，因而探索安全、便宜的适宜于本研究菌种发酵生产的NiR的电子供体种类和浓度，将对于该酶的应用提供应用指导。因此，研究其分离纯化、性质等，以便于对NiR的工业化生产及应用开发研究提供实验依据和基础。

基金项目：国家863计划课题（2008AA10Z306）；国家自然基金（20876164）作者简介：刘

），女，吉林长春人，副教授，研究方向为酶与发酵工程。萍（1970-

研究报告

1材料与方法1.1菌种和培养基

中国酿造

2011年第9期总第234期·23·

层析、透析、浓缩后的酶液上样于磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓pH值为6.5）预平衡好的SephadexG-75葡冲液（50mmol/L，聚糖凝胶柱（准1cm×75cm）。用同一缓冲液进行洗脱，洗脱流速为0.3mL/min，自动分布收集仪收集洗脱液，每3mL收收集具有集一管。检测每管洗脱液的蛋白含量及酶活力，酶活的组分，4℃保存，用于分子量测定及酶学性质研究。1.4蛋白质含量测定、NiR酶纯度检测及亚基的相对分子

量测定

蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法[15]，以牛血清蛋白作为标准蛋白。

对各步骤分离纯化所得酶液以SDS-PAGE凝胶电泳检测其蛋白纯度[16]。分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%，电极缓冲液为Tris-甘氨酸（pH值为8.3）；电泳条件为恒压。

将样品与已知分子量的标准蛋白质进行SDS—PAGE电泳，然后以相对迁移率对分子量对数作图，从图中求出亚硫酸盐还原酶的亚基相对分子质量。1.5NiR酶活力测定

参照文献[14]略作修改。测定酶活反应体系共250μL：0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH值为6.5）125μL，0.1mol/LNaCl0.1mol/LNO212.5μL，0.1mol/LMV7.5μL，0.1mol/L15μL，

Na2S2O440μL，酶液50μL。30℃水浴中反应10min，剧烈振。取10μL加格利斯试荡终止反应（以磷酸缓冲液为空白）剂显色，在波长538nm处比色法测定亚硝酸盐的变化。（酶活定义：每分钟所还原1nmoL亚硝酸盐所需要的酶量定义为一个酶活力单位）

1.6NiR酶反应的最适温度及温度稳定性

（pH值为在50mmol/L磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲体系6.5）中，在不同温度（20℃~80℃）测定亚硝酸盐还原酶的酶活力，以最大值为100%。在不同温度（50℃~90℃）保温不同时间后，然后按标准方法测定亚硝酸盐还原酶的剩余酶活力（用未经处理的酶液作对照）。1.7NiR酶反应的最适pH值及pH值稳定性

采用不同缓冲体系配成一系列浓度为50mmol/L缓冲液。pH值为5.8~9.1，缓冲体系和pH值范围分别为MOPS缓冲液，pH值为5.8~7.8；Tris-HCl缓冲液，pH值为7.8~9.1；测定酶活力最大值为100%。将酶液与不同pH值的缓冲液混合后，在30℃保温2h，然后按标准方法测定亚硝酸盐还原。酶的剩余酶活力（用未经处理的酶液作对照）1.8金属离子和EDTA对NiR酶反应的影响

分别取等量纯化得到的酶液，在每份酶液中加入一定量的各种金属离子（或EDTA），反应体系中各金属离子（或EDTA）的最终浓度为1mmol/L。在标准条件下取等量的酶液测定其酶活。

1.9NiR酶的最大反应速度及米氏常数

在最适pH值、温度条件下，以亚硝酸钠为底物，根据

巨大芽孢杆菌B.megateriumMPF-906：由本实验室分离并保藏。

菌种保藏斜面培养基配方：营养肉汤18g，琼脂20g，NaNO20.138g，定容至1L，调节pH值为7.0，121℃灭菌20min。

种子培养基：葡萄糖15.0g，蛋白胨2.0g，K2HPO41.35g，KH2PO40.70g，MgSO4·7H2O0.10g，NaCl1.0g，CaCl2·2H2OMnSO·定容至1L，调节pH值为7.0，121℃0.02g，4H2O0.01g，灭菌20min。

发酵培养基：葡萄糖1.5%，NaNO22mmol/L，牛肉膏0.2%，硫酸铵0.1%，K2HPO40.135%，KH2PO40.07%，NaCl0.1%，MgSO4·7H2O0.04%，MnSO4·H2O0.001%，CaCl2·2H2O0.002%。121℃灭菌20min，在接种量4%（v/v）、30℃、160r/min的条件下发酵。1.2试剂

亚硝酸钠（分析纯），MV（甲基紫精，ALDRICH产），SephadexG-75和DEAE-46（华美进口分装，Pharmacia公司生产）。

1.3NiR酶的分离纯化

NiR粗酶液的制备：菌种自斜面培养基接入液体种子培养基活化后，将新鲜培养的种子液以4%的接种量接入发酵培养基中，30℃、120r/min振荡培养20h。培养结束后，摇（15000×g），沉淀菌体用磷瓶发酵液在4℃冷冻离心15min

酸缓冲液重新悬浮，然后再次离心得到菌体。将提取的菌体细胞，按1000mL培养液菌体细胞加100mL磷酸氢钠-磷pH值为6.5）超声波破碎，超酸二氢钠缓冲液（50mmol/L、声波条件为200W，超声5s，间歇10s，90次。4℃冷冻离心15min（26000×g），上清液即为粗酶液。

（NH4）SO4分级沉淀：粗酶液中加入硫酸铵至30%饱和度，缓慢搅拌充分混合，4℃静置4h，离心（20min、26000×g、4℃），弃去沉淀留取上清液。在上清液中继续加入硫酸铵粉末至饱和度60%，缓慢搅拌充分混和，4℃静置过夜，离心（20min、26000×g、4℃）后，收集沉淀溶于20mL磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲液（50mmol/L、pH值为6.5）中，于4℃存放，作透析及下一步纯化备用。

DEAE-纤维素阴离子交换层析：将经过透析、浓缩后（50mmol/L，的酶液上样于磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲液

pH值为6.5）预平衡好的DEAE-Cellulose阴离子交换柱（准2cm×25cm），然后用0mol/L～0.5mol/L的NaCl盐溶液进行连续线形梯度洗脱，洗脱流速为1.5mL/min。自动分布收集仪收集洗脱液，每4mL收集一管，检测每管洗脱液的蛋白含量及酶活力，收集具有酶活的组分。将收集的酶液透析、浓缩后4℃保存备用。

SephadexG-75葡聚糖凝胶过滤层析：将经过离子交换

·24·

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LineWeaver-Burk双倒数作图法求Km和Vmax。1.10不同电子供体种类和浓度对NiR酶反应的影响

将酶反应体系中的电子供体MV和Na2S2O4替换为0.1mol/L的抗坏血酸、亚硝酸钠、草酸钠、硫代硫酸钠、连二亚硫酸钠，用缓冲液补至反应体系250μL；同时保留MV添加量，将其中的Na2S2O4替换成等量的亚硫酸钠、草酸钠、硫代硫酸钠，其他反应条件不变。研究电子供体替换Na2S2O4添加浓度为20mmol/L、50mmol/L、75mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L时对酶活的影响。2结果与讨论2.1酶的分离纯化

（NH4）SO4饱和度为30%～60%时，大部分酶活能够得到回收。将经分级沉淀并透析、浓缩过的酶液，利用DEAE-Cellulose层析柱对亚硝酸盐还原酶进行提纯，结果（图1）可看出，在整个洗脱阶段出现了4个大小不一的蛋白峰。检测洗脱液各管的亚硝酸盐还原酶活力，结果显示第7~17管的蛋白含量较高的蛋白峰，与亚硝酸盐还原酶的酶活峰相一致，该蛋白即为亚硝酸盐还原酶酶蛋白。将经过离子交换层析有酶活的部分透析平衡和浓缩后，上样于SephadexG-75凝胶层析柱，用同一缓冲液洗脱2个柱体积，收集有酶活力的部分（图2）。

胞杆菌中纯化的NiR与文献报道的纯化酶进行比较，结）表明，从巨大芽胞杆菌中分离纯化的NiR具有较果（表2高的比活力。

表1

B.megateriumMPF-906亚硝酸原酶的分离纯化

MPF-906

Table1.IsolationandpurificationofNiRfromB.megaterium总活性/

U557141781729345

总蛋白质含量/比活度/回收率/

（U·mg-1）%mg

323.9087.068.710.54

17.2047.99198.49638.63

10074.8631.016.19

纯度

（倍）1.002.7911.5437.13

项目粗提取物硫酸铵沉淀

）（30%~60%DEAE-纤维素葡聚糖G-75

表2

巨大芽胞杆菌产NiR与其他报道的NiR的酶对比情况

Table2.ComparisonofpurifiedNiRfromB.megateriumtothatfrom

otherbacteria亚硝酸盐还原酶

总蛋白质含量/比活度/

产量/%参考文献

mg（U·mg-1）

0.540.081.430.220.290.56

638.632596015.79214.40.202

6.190.917.843816

Thisstudy[17][18][19][20][21]

B.megateriumNiRH.denitrificansNiRH.marismortuiNiRH.mediterraneiNiRM.brauniiNiRH.thermophilusTK-6

NiR

通过SDS-PAGE电泳分析，呈现为单一条带（图3），说明酶液纯度已经达到电泳纯。根据SDS-PAGE电泳图，对照标准蛋白分子量进行分析计算，得到目标蛋白的亚基相对分子质量为35ku。这与Achromobactercyclolacles和

Pseudomonaschlororaphis的铜型亚硝酸盐还原酶的分子

量36ku和40ku接近，而细胞色素cdI型亚硝酸还原酶由2个

图1

亚硝酸原酶的DEAE-纤维素柱层析结果

相同的60ku亚基组成[22-23]。可以推断出该酶可能是铜型亚硝酸盐还原酶。

Figure1.ChromatographyofNiRonaDEAE-cellulosecolumn

图2SephadexG-75凝胶过滤层析结果图3纯化后酶液的SDS-PAGE电泳图

Figure2.GelchromatographicseparationofNiRonSephadexG-75Figure3.SDS-PAGEelectrophoresisofNiRafterpurification

各部纯化结果见表1。最终酶液的活力回收达到6.19%，纯度倍数达到37.13倍。从巨大芽比活力为638.63U/mg，

2.2酶催化的最适反应温度及温度稳定性

图4为在不同的温度条件下对酶活力的比较，从图4可

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中国酿造

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以看出，巨大芽胞杆菌在20℃~80℃范围内均有酶活，酶反在30℃～50℃酶活均较高。随着温度应的最适温度为40℃，

的升高，酶活力也逐渐升高，但是当温度高于40℃后，酶活力下降。将酶在不同温度下保温4h后的温度稳定性实验表在80℃保温4h后酶活明，该酶在70℃以下相对比较稳定，力仍保持50%以上，说明该酶耐热性较好（图5）。由于在为了避免肉制品加工过程中，肉在4℃时完成斩拌后灌肠，微生物生长及腐败，快速加热到75℃以上，一般的酶制剂在该条件下已完全失活，因而由巨大芽胞杆菌发酵生产的NiR具有在香肠加热后仍具有酶活的能力，可以将残余的亚硝酸盐分解，为无硝香肠的制备提供新的方法。

对照样品提高了23%。JAVIERV等[20]报道螯合剂EDTA抑此外还制酶活性；实验中发现EDTA有助于酶活力的提高，发现Cu2+能显著提高酶活力，Mn2+、Pb2+对酶活力有明显抑制作用，Na+、Fe3+、Mg2+、Al3+对其有轻微抑制作用，Ca2+、Zn2+对酶活力影响不大。造成这些差异的主要原因可能是菌种和反应条件的不同。

图6NiR酶催化的最适pH值

Figure6.OptimalpHvalueforNiRenzymaticreaction

图4NiR酶催化的最适温度

Figure4.TheoptimaltemperatureforNiRenzymaticreaction

图7pH值对NiR稳定性的影响

Figure7.EffectsofpHvalueonthestabilitiesofNiR

表3

金属离子和EDTA对酶活性的影响

Table3.EffectofmetalionsandEDTAonactivityofpurifiedNiR

图5

温度对NiR稳定性的影响

金属离子CKNa+Mn2+Fe3+Ca2+Cu2+

相对活性/%

100846487109347

金属离子EDTAZn2+Mg2+Pb2+Al3+Ba2+

相对活性/%

123101822887132

Figure5.EffectsoftemperatureonthestabilitiesofNiR

2.3酶反应的最适pH值及pH值稳定性

酶液与不同pH值缓冲液配置的底物溶液反应，实验结果（图6）表明，该酶最适反应pH值为6.5，在pH值为6～7时酶活力均较高。经不同pH值处理2h后的实验结果（图7）显示，残余酶活都在60%以上。该酶在pH值为5.5～8.5时均较稳定，2.4金属离子和EDTA对酶活性的影响

金属离子和EDTA对酶活性的影响见表3，各种离子均对酶活力有不同程度的影响，发现Cu2+、Ba2+能提高酶活力，而Cu2+能显著提高酶活力，比对照提高了3倍多，估计该酶是铜型亚硝酸盐还原酶；Mn2+、Pb2+对酶活力有明显抑制作用；Na+、Fe3+、Mg2+、Al3+对其有轻微抑制作用；Ca2+、Zn2+对比酶活力影响不大。螯合剂EDTA能提高一定的酶活力，

2.5酶的最大反应速度及米氏常数

按照Lineveaver-Burk作图法（见图8），以亚硝酸钠为底Vmax=4.1U/mg。物，测得该亚硝酸盐还原酶的Km=8.6mmol/L，2.6巨大芽胞杆菌产NiR的电子供体筛选

不同电子供体种类对NiR酶活的影响见图9。单独添加不同电子供体均能检测到NiR酶活，其中亚硫酸钠和硫代硫酸钠测得的酶活相对较高，但与MV+连二亚硫酸钠相

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3结论

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比，亚硫酸钠只测出其中50%左右的酶活。添加MV作为复硫代硫酸钠和连二亚硫酸钠均测合电子供体时，草酸钠、定出较高的酶活，其中以MV+连二亚硫酸钠测得的酶活最高。不同电子供体浓度对NiR酶活测定影响显著（图10），低浓度的抗坏血酸单独添加能够辅助酶降低更多的亚硝酸钠，表现更高的酶活；随着抗坏血酸添加浓度的提高，草酸测定的酶活逐渐下降。连二亚硫酸钠在0.1mol/L时、钠在0.075mol/L时也表现出相对高的酶活力。

DEAE-Cellulose柱层析、采用硫酸铵分级沉淀、

SephadexG-75凝胶过滤层析一系列纯化步骤，亚硝酸盐还原酶相对于粗酶液纯化了37.13倍，酶比活力为638.63U/mg，电泳分析为单一条带，达到了电泳纯。该酶回收率为6.19%，

酶分子量为35ku，最适温度和pH值分别为40℃和6.5，80℃时保温4h后仍有50%的酶活力，pH5.5～9.0均较稳定，残余酶活都在60%以上，铜离子可以显著提高其酶活。适宜于适宜于肉制品生产中应用酶反应的电子供体为MV和DT，的电子供体为抗坏血酸。参考文献：

[1]唐爱明，夏延斌.肉制品中亚硝酸盐降解方法，机理及研究进展[J].食品与机械，2004，20（2）：35-37，44.

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图8亚硝酸盐还原酶的动力学参数

Figure8.EnzymekineticsparametersofNiR

图9不同种类电子供体对NiR酶活的影响

Figure9.EffectsofdifferentkindsofelectrondonoronactivityofNiR

[11]ZUMFTWG.Cellbiologyandmolecularbasisofdenitrification[J].

MicrobiolMolBiolRev，1997，61（4）：553-616.

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图10ofNiR

不同电子供体浓度对NiR酶活的影响

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[16]郭尧君.蛋白质电泳实验技术[M].北京：科学出版社，2003.

Figure10.Effectsofdifferentelectrondonorconcentrationonactivity

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中国酿造

2011年第9期总第234期·27·

梅鹿辄葡萄自然发酵酵母菌群研究

孙

2

悦1，宋育阳1，刘延琳1，*

（1.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西杨凌712100；2.陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心，陕西杨凌712100）

摘要：利用WL营养培养基对梅鹿辄葡萄自然发酵过程中分离到的98株酵母菌进行初步鉴定，进而对代表性的菌株进行5.8SrDNA-ITS区PCR产物的限制性内切酶酶切分析。结果表明，供试的98株酵母菌属于3属3个种，分别为酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、

东方伊萨酵母（Issatchenkiaorientalis）、克鲁维毕赤酵母（Pichiakluyver），3种酵母菌分别占分离自该葡萄品种总酵母菌株的80.61%、13.26%、6.13%。在自然发酵的初期和中期，酵母菌的比例因是否添加SO2而有所差异，但发酵末期均以S.cerevisiae为优势菌。关键词：葡萄酒；自然发酵；WL营养琼脂培养基；5.8SrDNA-ITS中图分类号：TS261.1

文献标识码：A

文章编号：0254-5071（2011）09-0027-03

DiversityofwineyeastsduringspontaneousfermentationofMerlotSUNYue1,SONGYuyang1,LIUYanlin1,2*

(1.CollegeofEnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling712100,China;2.ShaanxiEngineeringResearchCenterforWineandViniculture,Yangling712100,China)Abstract:Ninety-eightyeastsisolatedfromspontaneousfermentationofMerlotwereidentifiedprimarilyonWallersteinLaboratorynutrientagar(WLagar)andclassifiedbyusingPCR-RFLPof5.8SrDNA-ITSregion.ThreespeciesofthreegenerabelongingtoSaccharomycescerevisiae,IssatchenkiaorientalisandPichiakluyveriwerefoundinthesestrains,withaproportionof80.61%,13.26%and6.13%,respectively.TheproportionofyeastsinthebeginningstageandmiddlestagevariedduetotheadditionofSO2.However,S.cerevisiaebecomethedominationintheendstage.Keywords:wine;spontaneousfermentation;WallersteinLaboratorynutrientagar;5.8SrDNA-ITS

葡萄酒的自然发酵是一个由不同的酵母属、种之间相互协作的复杂过程。酵母菌的多样性、发酵过程中酵母菌群体组成及其酿酒特性，对葡萄酒的质量有重要贡献[1]。酵母菌的分类鉴定方法已由传统鉴定方法（形态学鉴定和生理生化鉴定）发展到传统鉴定方法与分子生物学鉴定方法相结合的阶段。目前常用的酵母菌分子鉴定方法包括：26SrDNAD1/D2区的测序分析和5.8SrDNA-ITS区的测序以及酶切分析。对于真菌而言，5.8S-ITS区位于18SrRNA

和28SrRNA之间，该区域可以用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增得到，不同种生物的5.8S-ITS区长短和序列都不相同，使用其进行研究真菌群落可以鉴定到种的水平，甚至是菌株水平[2]。WL营养培养基（Wallersteinlaboratorynutrientagar）是Wallerstein实验室设计的观测酿造和工业发酵过程中微生物种群的非选择型培养基，基于酵母菌在WL培养基上生长所形成的菌落颜色及形态对其进行区别和归类[3]。研究表明，WL培养基可以区分葡萄酒发酵过

收稿日期：2011-04-07

基金项目：国家葡萄产业技术体系建设专项经费（nycytx-30）作者简介：孙

悦（1986-），女，辽宁铁岭人，硕士研究生，研究方向为酿酒微生物；刘延琳*，教授，通讯作者。

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