WB实验步骤

实验材料：

SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDS-PAGE Loading Buffer（还原，5×）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水 实验仪器、耗材：

蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用） 配制溶液：

 配制10%APS溶液：-20度保存

0.5g APS + 5ml蒸馏水、2.5g APS + 25ml蒸馏水

 配制200 ml电泳缓冲液：CW0045 Tris-Glycine SDS（ph8.3,10×）

20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水  配制1 ml loading buffer：

200 ul 5×loading buffer +800 ul蒸馏水 实验步骤： 一．制胶：

1. 参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。 2. 根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。

SDS-PAGE分离胶的浓度与最佳分离范围 SDS-PAGE分离胶浓度 6%胶 8%胶 10%胶 12%胶 15%胶

3. 配制10%分离胶：

将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。 加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。

配制SDS-PAGE分离胶

分离胶浓度 凝胶体积 双蒸水 所需各组分体积（单位：ml） 30%Acr-Bis(29:1) 分离胶缓冲液 （4×） 10%APS TEMED 最佳分离范围 50-150kD 30-90kD 20-80kD 12-60kD 10-40kD 5ml 10% 10ml 15ml 20ml 2.08 4.17 6.25 8.3 1.67 3.33 5.0 6.7 1.25 2.5 3.75 5 0.05 0.1 0.15 0.2 0.002 0.004 0.006 0.008 4. 待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。静置40分钟

至1小时。

5. 待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。

6. 配制5%浓缩胶：

配制5%SDS-PAGE浓缩胶 凝胶体积 双蒸水 2ml 4ml 6ml 8ml 1.14 2.28 3.42 4.56 所需各组分体积（单位：ml） 30%Acr-Bis(29:1) 0.34 0.68 1.02 1.36 浓缩胶缓冲液（4×） 0.5 1 1.5 2.0 10%APS 0.02 0.04 0.06 0.08 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 7. 将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。

注意：灌胶速度要快，防止凝胶。

8. 将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。静置20分钟，等待浓缩胶聚合。 9. 待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。赶走气泡。

二． SDS-PAGE电泳:

1. 在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。 2. 制备样品： 1） 蛋白样品：

根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。 蛋白提取液 + 5×上样缓冲液 + 蒸馏水，上样量为40-60ug。 制备的样品，煮沸5分钟，12,000 rpm离心5分钟，取上清，上样。 3. 上样：蛋白上样顺序如下： 泳道 样品 1 Marker 2 样品1 3 样品2 体积 10μl 20μl 20μl 4 样品3 20μl 5 样品4 20μl 6 样品5 20μl 7 样品6 20μl 8 样品7 20μl 9 样品8 20μl 10 样品9 10μl 4. 电泳：浓缩胶80V，约20分钟，分离胶100V，约1小时。

一、 考马斯亮蓝染色

注：将提取的植物蛋白进行电泳，电泳后进行考马斯亮蓝染色。全细胞裂解液电泳后，进行western blot检测。

1. 将电泳后的PAGE 胶取出放入容器中，加入适量蒸馏水（以充分覆盖PAGE 胶为 宜），加热至沸腾后5分钟，弃去蒸馏水；

2. 加入适量考马斯亮蓝染色液（液面覆盖凝胶即可）加热至沸腾后5分钟，弃染色液； 3. 加入适量蒸馏水，加热至沸腾后5分钟，弃蒸馏水，重复此步骤至背景清晰。 4. 观察拍照。

Western Blot

溶液配制：

 配制500 ml 1×TBST溶液：

50 ml TBST（ph8.3,10×）+ 450 ml 蒸馏水  配制100 ml 5%牛奶封闭液：4度保存

5克脱脂奶粉+ 100 ml 1×TBST

 配制100 ml转膜缓冲液（甲醇）：CW0044 Tris-Glycine（ph8.3,10×）

10 ml Tris-Glycine + 20 ml 甲醇 + 70 ml 蒸馏水 （4度保存）

一．转膜及染色

实验材料：NC膜、滤纸、转膜缓冲液、丽春红染色试剂、水平摇床 实验仪器、耗材：转膜仪 实验步骤：

1. 电泳完成后，小心打开玻璃板，去除浓缩胶，将分离胶剥离后，放入转膜缓冲液中平衡。 2. 用剪刀剪相同大小的NC膜及滤纸，放入转膜缓冲液中平衡。 3. 转膜：（半干转）

1） 将平衡好的3层滤纸平铺于转膜槽底部。滴加转膜液润湿。 2） 将胶平铺在滤纸上，赶平去气泡。

3） 将平衡好的NC膜平铺在胶上，用玻璃棒赶平，确保膜与胶之间没有气泡。 4） 再将3层滤纸平铺于膜上，赶平。

5） 盖好转膜槽上盖，压紧。插上电极，50mA/膜，转膜1小时。

转膜：（湿转）

150mA/膜，转膜1.5小时 4. 丽春红染色

1） 将转移后的膜完全浸入丽春红染色液中，摇动3-5分钟。 2） 蒸馏水漂洗膜2-3次，直至膜上出现清晰条带。 3） 再次用蒸馏水漂洗，去除染料。 二．封闭

实验材料：5%脱脂奶 封闭液

实验步骤：用封闭液将膜室温封闭1小时

三．抗体检测：检测β-actin，分子量43KDa

实验材料：5%脱脂奶封闭液、抗β-actin鼠单克隆抗体、山羊抗鼠IgG（H+L）HRP、TBST 实验步骤：

1. 在6 ml 5%的脱脂奶中加入2 μl抗β-actin鼠单克隆抗体（稀释度为1:3000）。 2. 将膜浸入到一抗稀释液中，室温孵育1小时，或者4℃ 孵育过夜。 3. TBST漂洗7次，每次5分钟。

4. 在10 ml 5%的脱脂奶中加入2 μl山羊抗鼠IgG（H+L）HRP（稀释度为1:5000）。 5. 将膜浸入到二抗稀释液中，室温孵育1小时。 6. TBST漂洗7次，每次5分钟。 四．显影

实验材料：DAB显色液 实验步骤：

1. 将试剂A和B以1:19的体积比混匀后即为DAB显色工作液。 2. 将配制好的DAB工作液滴加到印迹膜上，孵育1-5分钟，显色。 3. 将膜放入蒸馏水中，终止反应。