骨髓间充质干细胞向纤维软骨细胞表型的诱导分化

蔡贵泉;崔一民;陈晓东

【摘 要】背景:半月板损伤后自行修复能力有限,组织工程技术为半月板损伤后修复开辟了一条新的途径.骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,有可能成为半月板组织工程理想的种子细胞.目的:观察体外培养的猪骨髓间充质干细胞在诱导培养液作用下向纤维软骨细胞表型分化的可行性.方法:采用全骨髓培养法分离培养猪骨髓间充质干细胞.取第3代的骨髓间充质干细胞,实验组以2.0×10~4/cm~2细胞密度接种于24孔板,在含有转化生长因子β1、胰岛素样生长因子Ⅰ、地塞米松及抗坏血酸的DMEM-LG完全培养液中诱导分化,对照组以2.0×10~4/cm~2细胞密度接种于24孔板,加入不含诱导因子的DMEM-LG完全培养液.在诱导第7,14,21天分别行甲苯胺蓝染色、免疫细胞化学染色检测其分化结果.结果与结论:①第2代骨髓间充质干细胞的群体倍增时间最短约为2 d,第4代以后相对延长,为5～9 d.②诱导后的骨髓间充质干细胞由梭形向多角形、多边形转变.③实验组可见胞浆呈明显的紫蓝色,尤其细胞密集生长的区域蓝染较深,染色强度随诱导时间延长而增强.对照组的骨髓间充质干细胞只有核蓝染.④实验组和对照组Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色均阳性,各期染色无明显差异.对照组未见Ⅱ型胶原表达,实验组诱导14 d后可见Ⅱ型胶原能稳定的表达.提示骨髓间充质干细胞在体外诱导培养下可分泌纤维软骨细胞特征性细胞外基质,作为半月板组织工程种子细胞来源可行. 【期刊名称】《中国组织工程研究》 【年(卷),期】2010(014)002 【总页数】5页(P218-222)

【关键词】骨髓间充质干细胞;纤维软骨细胞;诱导;分化;软骨组织工程 【作 者】蔡贵泉;崔一民;陈晓东

【作者单位】上海交通大学医学院附属新华医院骨科,上海市,200092;上海交通大学医学院附属新华医院骨科,上海市,200092;上海交通大学医学院附属新华医院骨科,上海市,200092 【正文语种】中 文 【中图分类】R318

人膝关节半月板损伤是骨科的常见病，随着对半月板功能及半月板切除后并发症认识的不断深入，人们意识到修复和保留半月板功能的重要性[1-2]。组织工程技术使修复甚至再造半月板成为可能。组织工程化半月板的重要条件之一是必须获得大量的有功能和活力的纤维软骨细胞，而骨髓间充质干细胞是存在于骨髓内的一种具有多向分化潜能的成体干细胞，可在体外大量培养扩增，有可能成为组织工程较为理想的种子细胞来源。实验旨在建立一种骨髓间充质干细胞向纤维软骨细胞表型分化的体外培养体系，对体外诱导培养不同时期的骨髓间充质干细胞进行连续鉴定，从而为骨髓间充质干细胞作为半月板组织工程的种子细胞来源提供理论和实验依据。 1 材料和方法

设计：成组设计，细胞形态学，免疫细胞化学实验。

时间与地点：实验于2008-05/2009-03在上海交通大学医学院附属新华医院科研中心完成。 材料：

实验动物：45 d龄长枫杂交猪5只，体质量6～8 kg，雌雄不限，由上海市南汇

县老港镇特种养殖场提供。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准[3]。 主要试剂：

实验方法：

取材：实验动物以氯胺酮(2 mg/kg)、0.25%戊巴比妥钠(0.2 mL/kg)肌肉注射麻醉，以骨髓穿刺针垂直穿刺入髂骨骨髓腔，抽取骨髓6～8 mL，立即注入含30 mL肝素化无血清DMEM-LG培养液至50 mL无菌离心管中，混匀制成细胞悬液。 骨髓间充质干细胞的分离培养及扩增：参照全骨髓培养法[4-5]，将细胞悬液以1 500 r/min离心8 min，弃上清液，以PBS清洗3次，去除上层脂肪及组织液，下层即为含骨髓间充质干细胞的有核细胞层。加入DMEM-LG完全培养液(含体积分数10%胎牛血清、L-谷氨酰胺300 mg/L、抗坏血酸50 mg/L、青霉素100 U/mL、链霉素100 mg/L)，计数有核细胞，以1×109 L-1有核细胞接种入直径100 mm培养皿，置于37 ℃、体积分数为5%CO2、100%饱和湿度培养箱中培养。培养的第5天进行首次换液，吸除悬浮有大量红细胞的培养液，PBS洗涤3次后加入新鲜培养液，继续培养，每周换液2次，OLMPUS倒置相差显微镜逐日观察细胞形态及生长情况。待细胞生长融合达80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化，传代，按1.5×104/cm2细胞密度接种传代扩增。 群体倍增时间(population double time, PDT)测定：将各代细胞按1×105/孔接种到6孔板上，待细胞融合达80%～90%时，用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化、计数，按公式(T-T0)× ln2/(lnN-lnN0)可得到各代细胞的群体倍增时间。以1/lnPDT代表细胞增殖速度，绘制趋势图。其中T0为初始接种时间，T为中止消化时间，N0为初始接种细胞数，N为中止消化时细胞数。

骨髓间充质干细胞的诱导分化：取第3代细胞分为2组，实验组以2.0×104/cm2细胞密度接种于24孔板，分别加入1 mL DMEM-HG完全诱导培养液(含体积分

数10%胎牛血清、转化生长因子β1 10 μg/L、胰岛素样生长因子Ⅰ50 μg/L、地塞米松40 μg/L、L-谷氨酰胺300 mg/L、抗坏血酸50 mg/L、青霉素100 U/mL、链霉素100 mg/L)；对照组以2.0×104/cm2细胞密度接种于24孔板，分别加入1 mL DMEM-LG完全培养液，内置爬片，置于37 ℃、体积分数为5%CO2、100%饱和湿度培养箱中培养，每周换液2次，分别在诱导后第7，14，21天取出爬片，行蛋白多糖甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学染色。

甲苯胺蓝染色：实验组和对照组分别在诱导培养第7，14，21天取出爬片，丙酮固定5 min，PBS冲洗，1%甲苯胺蓝室温染色30 min，洗去多余的染液，梯度脱水，透明，中性树胶封固。

免疫细胞化学染色：实验组和对照组分别在诱导和培养第7，14，21天取出爬片，丙酮固定5 min，PBS洗3次，0.25%TritonX-100通透10 min，PBS洗3次，体积分数为3%H2O2封闭内源性过氧化物酶15 min，PBS洗3次，体积分数10%非免疫羊血清30 min，后弃去非免疫血清，加入0.5%牛血清白蛋白稀释的1∶50鼠抗人Ⅰ型胶原抗体/鼠抗人Ⅱ型胶原抗体，置湿盒4 ℃过夜，PBS洗3次，加辣根过氧化物酶标记二抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，DAB显色5 min，苏木精复染，梯度脱水，透明，中性树脂封固。以不加一抗样本作为空白对照，正常猪半月板纤维软骨免疫组化作阳性对照。

主要观察指标：①骨髓间充质干细胞的群体倍增时间。②诱导分化后的光镜形态变化。③甲苯胺蓝染色检测蛋白多糖表达。④免疫细胞化学染色检测Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原表达。

设计、实施、评估者：实验设计、实施由第一作者完成，结果评估为第二、三作者完成。

统计学分析：由第一作者采用SPSS 11.5统计软件分析处理，检测数据以±s表示，实验组和对照组的阳性率比较采用成组设计的两样本均数比较t 检验，实验组内不

同诱导时间阳性率比较采用单因素方差分析，P ＜ 0.05则认为差异有显著性意义。 2 结果

2.1 倒置相差显微镜观察结果 原代细胞培养5 d后首次换液，即可看到贴壁的细胞小克隆，细胞形态呈较一致的长梭形、纺锤形，细胞较小，呈克隆性生长(图1)。 Figure 1 The spindle-like, adherently growing primary cells cultured for 5 days (inverted phase contrast microscope, ×100)图1 原代细胞培养5 d，呈长梭形贴壁生长(倒置相差显微镜，×100)

随培养时间的延长，悬浮细胞逐渐坏死破碎，随换液次数增多而被清除。细胞克隆不断扩大，呈放射状向周围扩展，逐渐与邻近克隆汇合，10～14 d可达到80%～90%的融合，细胞排列呈螺旋状或漩涡状。传代细胞接种2～4 h后，开始附壁铺伸，24 h后已基本完成贴壁，48～72 h开始快速增殖，4～7 d时可达80%～90%的融合。传代细胞与原代相比，生长较快，细胞均一性更好，呈长梭形。诱导因子加入后，细胞的增殖速度明显低于对照组，细胞形态由梭形向多角形、多边形转变，有明显的聚集生长现象，有些密集区可形成结节。

2.2 群体倍增时间 第1～10代细胞的增殖情况及换算得到的PDT值见表1。 表1 第1～10代细胞的增殖情况和群体倍增时间Table 1 The proliferative activity and population double time(PDT) of cells from Passage 1 (P1) to P10Cell passage Inoculum size(×106)Culture time(h)Fusion size(×106) PDT (h)P171.40 P2 1.00 115 5.60 46.27 P3 1.00 167 4.00 83.50 P4 1.00 222 2.55 164.38 P5 1.00 145 2.10 135.46 P6 1.00 190 2.30 158.12 P7 1.00 219 2.40 173.39 P8 1.00 210 2.10 196.19 P9 1.00 220 2.15 199.21 P10 1.00 218 2.35 176.85 1.001193.18

以1/lnPDT代表细胞的增殖速度，可得到各代细胞增殖速度趋势图(图2)。 Figure 2 Tendency graph of proliferative speed for bone marrow

mesenchymal stem cells undergoing in vitro monolayer culture图2 体外单层培养骨髓间充质干细胞的增殖速度趋势图

由表1及图2可见，第2代的PDT最短，第4代以后PDT相对延长，但第4～10代细胞的PDT差异不显著。按此推算，第1～3代共约17 d，细胞可扩增到71.2倍，足以满足一般半月板缺损的组织工程修复的要求。

2.3 蛋白多糖甲苯胺蓝染色 实验组诱导后可见胞浆呈明显的紫蓝色，尤其细胞密集生长的区域蓝染较深，染色强度随诱导时间延长而增强(图3)。对照组的骨髓间充质干细胞只有核蓝染。

Figure 3 The dark blue cytoplasm of bone marrow mesenchymal stem cells induced for 21 days, toluidine blue stainging(×200)图3 实验组细胞诱导21 d，甲苯胺蓝染色细胞胞浆呈深蓝色(×200) 2.4 Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色 Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色显示：

实验组诱导7，14，21 d的骨髓间充质干细胞胞浆均呈现明显的棕褐色，各期染色无明显差异(图4)。对照组亦为阳性(图5)。 Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色显示：

实验组诱导7 d的骨髓间充质干细胞在细胞密集处，个别细胞胞浆中呈明显棕褐色，大部分细胞胞浆呈不明显黄棕色(图6)；诱导14 d的骨髓间充质干细胞呈现广泛的棕褐色染色，在细胞密集处染色更深(图7)；诱导21 d的骨髓间充质干细胞同诱导14 d的骨髓间充质干细胞。对照组骨髓间充质干细胞未见棕褐色颗粒。 Figure 4 Cells in the experimental group showed positive result to collagen type Ⅰ immunocytochemical staining after being induced for 21 days (×200)图4 实验组细胞诱导21 d，Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色阳性(×200) Figure 5 Cells in the control group showed positive result to collagen

typeⅠimmunocytochemical staining(×200)图5 对照组细胞Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色阳性(×200)

Figure 6 Cells in the experimental group showed weakly positive result to collagen type Ⅱimmunocytochemical staining after being induced for 7 days (×200)图6 实验组细胞诱导7 d，Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色弱阳性(×200) Figure 7 Cells in the experimental group showed positive result to collagen type Ⅱimmunocytochemical staining after being induced for 14 days (×200)图7 实验组细胞诱导14 d，Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色阳性(×200) 2.5 不同诱导时间Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色阳性率的比较 见表2。

表2 不同诱导时间Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色阳性率的比较Table 2 Comparison of collagen type Ⅱpositive cells ratio in different times (±s, n =10, %)aP ＜ 0.01, vs. control group; bP ＜ 0.01, vs. day 7Group 7 d 14 d 21 d Experimental 32.91±6.22a 89.20±4.43ab 87.70±4.85ab Control 1.23±0.31 1.17±0.17 1.18±0.18 3 讨论

种子细胞来源是半月板组织工程的首要问题。半月板纤维软骨细胞来源有限，体外扩增时间长，且随年龄增大糖氨聚糖和胶原合成能力明显下降[6]，限制了半月板纤维软骨细胞在临床上的使用。间充质干细胞广泛存在于骨髓、骨膜和软骨膜中，它繁殖能力强，体外培养达30代以上，细胞数目扩增100万倍以上仍保持良好的多分化潜能[7]。骨髓间充质干细胞以其来源充足、取材方便、创伤小、增殖能力强、无排斥反应、不存在伦理问题、易于多种载体基因转导等优点[8]，被公认为有可能成为软骨组织工程理想的种子细胞来源。Yamasaki等[9]使用同种异体鼠半月板支架，接种入鼠骨髓间充质干细胞后体外培养4周，然后移植入体内缺损处，术后4周和8周荧光显微镜可以检测到移植半月板内有骨髓间充质干细胞存活，

甲苯胺蓝和番红-O染色可以显示糖氨聚糖合成，且随时间增多。但该实验未对胶原合成进行检测。本实验的目的是在体外单层培养条件下，使骨髓间充质干细胞向纤维软骨细胞表型诱导分化。

本实验应用高糖DMEM培养基对骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞具有明显的促进作用。因为软骨细胞和骨髓间充质干细胞在体外单纯培养中会逐渐凋亡，高糖培养基可改变细胞新陈代谢，从而降低对凋亡的敏感性，有利于骨髓间充质干细胞存活[7]。本实验将转化生长因子β1、胰岛素样生长因子Ⅰ、地塞米松、抗坏血酸联合使用，力求获得较大的促增殖效应和软骨诱导效应。转化生长因子β系列生长因子是一族具有多种功能的多肽，它能够促进细胞增殖，调节细胞分化，促进细胞合成并分泌细胞外基质[10]。转化生长因子β1的信号通过smad途径传导入核，激活sox9。sox9是一类转录调控因子，它能促进细胞中Ⅱ型胶原基因的表达，最终促进Ⅱ型胶原的分泌[11-12]。胰岛素样生长因子Ⅰ是一种强有力的合成代谢刺激因子，能显著促进有丝分裂，可促进软骨细胞增殖和成熟，合成软骨基质蛋白多糖，且可促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，有利于软骨的生长。其与转化生长因子β1协同在早期促进骨髓间充质干细胞增殖和分化更加明显[13]。培养基中加入地塞米松亦有协同促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的作用[14]。抗坏血酸是一种抗氧化剂，可抑制或减少凋亡的产生。

国内外许多研究亦使用转化生长因子β1等诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，但诱导成透明软骨细胞还是纤维软骨细胞尚无定论。纤维软骨细胞以合成Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和蛋白多糖为特征，其中Ⅰ型胶原为纤维软骨所独有[15]。本实验证实，在该实验培养体系下，实验组骨髓间充质干细胞经诱导后仍能持续表达Ⅰ型胶原；Ⅱ型胶原在诱导前不表达，诱导14 d后能稳定的表达；蛋白多糖经诱导后表达增加，提示骨髓间充质干细胞经诱导后能同时表达Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原及蛋白多糖，即有向着纤维软骨细胞表型方向分化的可行性。本实验仅从免疫组化方面定性鉴定

细胞诱导分化情况，诱导后Ⅰ型胶原虽然能持续表达，但其表达量是否有明显改变仍不清楚，有必要通过蛋白电泳或聚合酶链反应等进行定量检测。

半月板是一个异质体，Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原在半月板内部和外部的含量不同[16]。同时体外单层培养环境不如体内环境复杂，体内半月板纤维软骨细胞之间、细胞与基质之间存在着复杂的调控机制，且半月板处于应力环境中[17]，其各部位的纤维软骨细胞所承受的应力也不同。人们已经观察到对软骨细胞施加应力刺激，不仅可以维持细胞表型，还可以促进细胞的合成与增殖，甚至改变细胞的组织结构[18-19]。因此，压应力对诱导后细胞表型的维持，以及不同诱导因素的组合对细胞外基质合成的影响有待进一步研究。且本实验仅从细胞学水平验证骨髓间充质干细胞向纤维软骨细胞表型分化，有必要从分子生物学水平进一步探索骨髓间充质干细胞诱导成纤维软骨细胞的信号传导和分化机制，以及诱导后的纤维软骨细胞表型如何长期维持，从而为半月板组织工程提供更多的实验基础。 4 参考文献

[1]McKinley TO, English DK, Bay BK. Trabecular bone strain changes resulting from partial and complete meniscectomy. Clin Orthop Relat Res. 2003;(407):259-267.

[2]Alford JW, Lewis P, Kang RW,et al. Rapid progression of chondral disease in the lateral compartment of the knee following meniscectomy. Arthroscopy. 2005;21(12):1505-1509.

[3]The Ministry of Science and Technology of the People’s Republic of China. Guidance Suggestions for the Care and Use of Laboratory Animals. 2006-09-30.

中华人民共和国科学技术部. 关于善待实验动物的指导性意见.2006-09-30. [4]Friedenstein AJ, Chailakhyan RK, Gerasimov UV. Bone marrow

osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell Tissue Kinet. 1987;20(3):263-272.

[5]Zhou G, Liu W, Cui L,et al. Repair of porcine articular osteochondral defects in non-weightbearing areas with autologous bone marrow stromal cells. Tissue Eng. 2006;12(11):3209-3221.

[6]Verbruggen G, Cornelissen M, Almqvist KF,et al. Influence of aging on the synthesis and morphology of the aggrecans synthesized by differentiated human articular chondrocytes.Osteoarthritis Cartilage. 2000;8(3):170-179.

[7]Johnstone B, Hering TM, Caplan AI,et al. In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Exp Cell Res. 1998;238(1):265-272.

[8]Izuta Y, Ochi M, Adachi N,et al. Meniscal repair using bone marrow-derived mesenchymal stem cells: experimental study using green fluorescent protein transgenic rats. Knee. 2005;12(3):217-223. [9]Yamasaki T, Deie M, Shinomiya R,et al. Transplantation of meniscus regenerated by tissue engineering with a scaffold derived from a rat meniscus and mesenchymal stromal cells derived from rat bone marrow. Artif Organs. 2008;32(7):519-524.

[10]Worster AA, Nixon AJ, Brower-Toland BD,et al. Effect of transforming growth factor beta1 on chondrogenic differentiation of cultured equine mesenchymal stem cells. Am J Vet Res. 2000;61(9):1003-1010.

[11]Attisano L, Wrana JL. Signal transduction by the TGF-beta superfamily. Science. 2002;296(5573):1646-1647.

[12]Kawamura K, Chu CR, Sobajima S,et al. Adenoviral-mediated transfer of TGF-beta1 but not IGF-1 induces chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet cultures.Exp Hematol. 2005;33(8):865-872. [13]Fukumoto T, Sperling JW, Sanyal A,et al. Combined effects of insulin-like growth factor-1 and transforming growth factor-beta1 on periosteal mesenchymal cells during chondrogenesis in vitro.Osteoarthritis Cartilage. 2003;11(1):55-64.

[14]Stewart AA, Byron CR, Pondenis HC,et al. Effect of dexamethasone supplementation on chondrogenesis of equine mesenchymal stem cells. Am J Vet Res. 2008;69(8):1013-1021.

[15]Detamore MS, Athanasiou KA. Motivation, characterization, and strategy for tissue engineering the temporomandibular joint disc.Tissue Eng. 2003;9(6):1065-1087.

[16]Cheung HS. Distribution of type I, II, III and V in the pepsin solubilized collagens in bovine menisci. Connect Tissue Res.1987;16(4):343-356. [17]Sweigart MA, Athanasiou KA. Tensile and compressive properties of the medial rabbit meniscus. Proc Inst Mech Eng H. 2005;219(5):337-347. [18]Wang G,Liu Y,Shan YX,et al.Zhongguo Xiufu Chongjian Waike Zazhi. 2004;18(2):96-99.

王刚,刘一,单玉兴,等.不同应力环境对兔骨髓间充质干细胞修复关节软骨缺损的影响[J].中国修复重建外科杂志,2004,18(2):96-99.

[19]Angele P, Yoo JU, Smith C,et al. Cyclic hydrostatic pressure enhances the chondrogenic phenotype of human mesenchymal progenitor cells differentiated in vitro. J Orthop Res. 2003;21(3):451-457.

来自本文课题的更多信息--

课题价值：课题得到上海市教育委员会科研创新项目(08YZ37)“压应力对构建半月板代谢及生物力学的影响”资助，旨在将猪骨髓间充质干细胞进行体外诱导培养，复合同种异体脱钙骨基质，研究不同条件的循环压应力对于组织工程化半月板结构、力学特性及其代谢的影响，从而为组织工程化半月板的临床应用打下基础。 同行评价：论文选题结合临床紧密，试图解决临床中的实际问题，设计合理，文字通顺，结果较可信。

偏倚或不足：实验方法主要是细胞培养、免疫组化，相对单一，若加上蛋白电泳等定量检测实验指标，则更有说服力。