线粒体信号肽的作用是什么?
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发布时间：2022-04-24 14:23
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时间：2023-10-16 06:03
构建葡萄糖调节蛋白75（GRP75）不同结构域 不同形式突变体与线粒体信号肽重组蛋白并鉴定其亚细胞定位 方法 通过重叠延伸PCR 将线粒体靶向信号肽序列分别与GRP75不同结构基因拼接 利用定点突变PCR分别扩增实现62和65位氨基酸突变的磷酸化失活型 磷酸化激活型突变体 482位氨基酸突变的底物结合缺陷型突变体及三位点同时突变重组体 将上述重组基因克隆pEGFPC1真核表达质粒 酶切和测序验证后分别用脂质体转染HeLa细胞 Western blot法检测重组蛋白表达水平 激光共聚焦显微镜观察比较重组蛋白亚细胞定位情况 结果 成功构建了线粒体信号肽融合或缺失的GRP75结构域 磷酸化失活和激活突变体 底物结合缺陷突变体真核表达质粒 各重组质粒的片段插入 位点突变 信号肽融合情况均符合设计目的 在HeLa细胞表达后产物的相对分子质量大小均符合预期 EGFP蛋白C端插入信号肽能引导下游融合的GRP75全长蛋白 结构域片段 突变体蛋白表达定位于HeLa细胞线粒体中 而缺失信号肽的对应重组蛋白则主要分布于胞质和局部核周 结论 构建了一系列GRP75重组真核表达质粒 EGFP融合信号肽能引导重组蛋白在线粒体中表达定位
