如何设定PCR引物的保护碱基?如何对PCR扩增的产物进行酶切?
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发布时间：2022-04-24 14:21
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时间：2023-10-16 04:42
PCR(Polymerase
Chain
Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤:
(1)
变性(Denature):目的双链DN*段在94℃下解链;
(2)
退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3)
延伸(Extension):在Taq
DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍(图4),这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106
倍。关于这方面的知识可以去生物帮那里了解，技术文档、视频资源，产品信息都比较丰富的。给我的帮助蛮大的。
如何做酶切反应?该问题看似什么简单：
DNA中加上酶，然后保温一段时间就可以了。但是在实际操作过程中，我们不断听到：切不动，装不上。问题在什么地方?能系列生产*性内切酶的公司国际上，就那么几个，位列前3
的是NEB,
Fermentas,
SibEnzyme。这些公司提供酶的品质一般都能得到保证。您可以怀疑酶的质量问题，但是更多的问题来源于模板是否合适酶切要求。下面几点对你的酶切是有帮助的。1)
成功酶切的关键是准备好模板DNA。DNA样品中不能含有有机溶剂(会使酶变性或产生星号货性)，不能含有干扰酶活性的污染物质，不能含有高浓度的EDTA
(TE中的EDTA浓度较低，对Mg的浓度影响较小);同时要对DNA甲基化程度及其对酶切效率的影响要做到心中有数。2)
选用合适的酶。根据酶切序列选用，特别注意选用甲基化对酶活性的干扰。3)
正确使用和保存酶。酶需要保存在-20度的低温环境中，只是在需要用酶才从冰箱中取出来。运输和临时存放时需要将酶至于冰上。手拿酶管时不要接触酶管下步含酶的部分，移酶时尽可能用长TIP,
避免污染。用完后需要及时送回原处。注意：酶通常是最后加。所有4)
反应体积需要根据实验目的定，常规的酶切一般要维持在10-50ul，酶切鉴定
10-20ul就可以了。5)
模板浓度问题：浓度过高，溶液黏度过大，酶不能有效扩散，酶切效果不会好。浓度过低，也会影响酶活性。6) 注意模板用量和反应体积的关系。对酶用量，模板用量，反应体积等要素的确定需要的是时间和经验的积累。7)
酶切反应的各个组分加完后，需要用TIP小心混匀几次，short
spin
一下就可以保温了。一般不能使用振荡器混匀。8)
反应温度的选择。一般反应都用37度，但是
Sma
I
的最适合温度是25度，37度时酶仍表现出活性，但是效率下降50%。部分从耐热菌制备的酶需要在37度以上的温度反应，如Taq
I的最适温度为65度，37度保温，效率仅为前者的1/10。9)
反应时间的选择。一般酶切鉴定30分钟就可以了。要完全酶切可以采用少量的酶长时间反应，或较高的酶量短时间处理都可以达到。在使用高酶量的时候需要注意甘油的最终浓度不要超过5%，也就是说10ul的体系，酶的用量不要超过1ul。10)
是否和如何终止反应?酶切鉴定之类的实验不需要特殊处理。灭活的手段：加入高浓度的
EDTA;65度或80度热处理20-30分钟;部分从高温菌纯化出来的内切酶由于最适的反应温度比较高，热处理灭活不一定完全，需要用苯酚/氯仿/乙醇方法纯化;电泳回收也是实验室常用除酶的手段。可以参考：please
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that
i
can
help
youPCR反应中的主要成份1.
引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)
引物长度约为16-30bp，
太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。(2)
引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度
Tm=4(G+C)+2(A+T).(3)
四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。(4)
引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应,
以减少由于密码子摆动产生的不配对。(5)
在引物内,
尤其在3'端应不存在二级结构。(6)
两引物之间尤其在3'端不能互补,
以防出现引物二聚体,
减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。
(7)
引物5'端对扩增特异性影响不大,
可在引物设计时加上*酶位点、核糖
体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等.
通常应在5'端*酶位点外再加1-2个保护碱基。(8)
引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构,
以免产生非特异性扩增,影响产量。
(9)
简并引物应选用简并程度低的密码子,
例如选用只有一种密码子的Met,
3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
PCR反应参数1.
变性：在第一轮循环前,在94℃下变性5-10min非常重要,它可使模板DNA完全解链,然后加入Taq
DNA聚合酶(hot
start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全,往往使PCR失败,因为未变性完全的DNA双链会很快复性,减少DNA产量.一般变性温度与时间为94℃
1min。在变性温度下,双链DNA解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含GC的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。2.
退火：引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度.实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃。一般当引物中GC含量高,长度长并与模板完全配对时,
应提高退火温度。退火温度越高,
所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用60℃和94℃)完成整个扩增循环,
既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。通常退火温度和时间为37℃-55℃,1-2min。3.
延伸：延伸反应通常为72℃,接近于Taq
DNA聚合酶的最适反应温度75℃.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为Taq
DNA聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,Taq
DNA聚合酶每分钟约可合成2kb长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列,
则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物,
这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。4.
循环次数：
当其它参数确定之后,
循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加。通常经25-30轮循环扩增后,
反应中Taq
DNA聚合酶已经不足,
如果此时产物量仍不够,
需要进一步扩增,
可将扩增的DNA样品稀释103-105倍作为模板,
重新加入各种反应底物进行扩增,
这样经60轮循环后,
扩增水平可达109-1010
。扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示:C=C0
(1+P)n
。其中：C为扩增产物量,C0
为起始DNA量,
P为增效率,
n为循环次数。在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，
减少非特异性产物。
