如何在线设计qPCR引物
发布网友
发布时间：2022-04-24 14:21
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热心网友
时间：2023-10-16 04:43
如果反转录体系里面有基因组残留，而且你的引物没有跨内含子，这样的情况下就很容易造成你的ct偏小（除了cdna扩增外，基因组的模板也会作为模板进行扩增，导致模板起始量偏高）；cdna逆转后是切除内含子的，而基因组是存在内含子的，如果你的引物设计在了跨两个外显子的区域，则只能扩增cdna而不扩增基因组。
引物不跨外显子设计也可以，但是必须保证你用的逆转录试剂盒里面的gdna
wiper
可以完全去除你的基因组，你实验的时候可以做一个nrt的对照看一下有没有基因组污染。我做好几个基因的引物就没有跨外显子设计，用的是r223
hiscript
ⅱ
q
rt
supermix
for
qpcr(+gdna
wiper)，每次nrt也没有扩增，去除基因组效果不错。
热心网友
时间：2023-10-16 04:43
设计引物原则
（1）引物最好在模板cDNA的保守区内设计；
（2）引物长度一般在15~30碱基之间，过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应；
（3）引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度，一般计算公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值；
（4）引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性；
（5）引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了；
（6）引物扩增长度：一般RT-PCR引物扩增长度在100-200bp,常规PCR扩增长度建议200-500bp。一般PCR产物达到2-3k长度也是可以的，但要考虑到可能引入突变，因此建议使用高保真的聚合酶。
