酵母双杂交的具体过程是什么?(中文)
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发布时间：2022-04-24 12:16
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时间：2023-09-10 20:16
菌株与质粒AH109酵母菌株(MATa，trp1．
901，leu2—3，112，ura3-52，his3-200，gal4A，gal8O~X，
LYS2：：G地1U^s-GALlT^T^-HIS3， G U^s—GAI2T^T^-
ADE2，URA3：：h吐1U^s．h吐1T^T^．1acZ)，YM187酵母
菌株(NATQ，um3-52，his3-200，ade2—101，trpl-901，
leu2-3，112，g △，met， O△，URA3：：GAL1U^s-
GAL1T^T^一laeZ，NE!,1)．I~BKT7-p53是编码鼠p53蛋
白(a．a．72—390)和GAL4 DNA BD(a．a．1—147)融合
蛋白的阳性对照质粒。pcArrr7．T是编码SV40大T
抗原(a．a．87—7O8)和GAL4 DNA．BD(a．a．1—147)融
合蛋白的阳性对照质粒，上述菌株与质粒均购自
CLONTECH公司。JIVl109大肠杆菌菌株购自promega
公司。
1．2 试剂鲑鱼精担体DNA，酵母培养用的YPD
Medium SD Minimal medium 一 DO Supplement 一Leu
DO Supplement、一Leu／一Trp DO Supplement、一Leu／Trp／His
DO Supplement、一Ade／一His／一L~aTrp 130 Supplement等
均购自CLONTECH。硫酸腺嘌呤(Adenine hemisul。
fate)购自Gibco。PEG 3250购自Sigma。DMSO购自
AMRESCO。*纤维素膜购自Phamacia。X-Gal购
自BBI。QIAprep Miniprep Kit购自QIAGEN公司，其
它常规分子生物学试剂购自北京华美生物公司。
1．3 pGBKT7．ps3和t~alrr7．T质粒的制备用2
mL LB液体培养基扩增pGBKT7一p53和pGADT7一T质
粒。分别用小规模碱裂解法【7 (AIK法)和QtarREP
Miniprep Kit试剂盒(QIAGEN法)提取质粒。紫外分
光光度法测0D260／280，并计算质粒DNA含量。
1．4 酵母双杂交共转化实验按酵母操作手册
建议的方法进行转化，取不同量的上述两种方法提
取的pGBKT7—053和pGADT7．T质粒共转化到AH109
酵母菌株中，将转化好的细胞按照1：10、1：100、1：
10003种不同浓度稀释，然后取100 铺于SD／
Trp／一Leu平板上，待长出克隆后计算生长克隆数目
(cfu)。计算共转化效率：转化效率cfu／／．tg DNA=cfu
×悬浮细胞体积( )×稀释倍数／[铺板体积( )×
DAN‘](*这里的DNA的量指的是所用一份的
质粒量而非全部质粒总量)。
1．5 酵母双杂交顺序转化实验取不同量的上述
两种方法提取的pGBKT7—053转化于AH109酵母菌
株，用SD／ TW缺陷培养基筛选得到AH109[pGBKT7—
53]，挑取新鲜的直径为2—3 iran的AH109[pGBKT7一
p53]酵母单克隆4—8个，接种于1 ml SD／一Trp缺陷
液体培养基中，旋涡振荡1 mira，彻底打散菌团。将1
IIll菌液转移到5O IIll的sD液体缺陷培养基中。将
pGADT7一T转化于AH109[pGBKTT-53]，其余方法同
酵母操作手册，将转化好的细胞按照1：10、1：100、1：
1000三种不同浓度稀释，然后取100 铺于SD／一
Trp／．Leu平板上，待长出克隆后计算生长克隆数目
(cfu)。按上述公式计算转化效率。
1．6 酵母双杂交交配实验 将pGBKT~．p53和
pGADTrT质粒分别转化于酵母菌株AH109和
YM187中，待在相应SD缺陷培养基平板上生长出
克隆后，分别各挑取一个2—3 nl／n酵母单克隆共放
置于一个含有0．5 ml YPDA液体培养基的1O IIll离
心管中，涡流震荡1 min，彻底打散菌团，3ocI=、200rpm过夜培养(20—24 h)。100 交配培养物铺于
SD／一 一Leu培养基平板，200 交配培养物铺于
SD／一His／一I~u／Tw(TDO )培养基平板。检测二倍体数
目：将交配产物按照1：10、1：100、1：1000三种不同浓
度稀释，然后取100 铺于SD／一Trp／．Leu平板。待长
出克隆后计数cfu。计算二倍体细胞数目：cfu×悬
浮细胞体积(ta)×稀释倍数／铺板体积(ta)。
1．7 窖a1分析实验
1．7．1 8一半乳糖苷酶的定性分析 检测AH109
[pGBKT7—053+pGADT7一T]的8一半乳糖苷酶活性，挑
酵母克隆(新鲜直径为2—3 mm)划双斜线于平铺在
相应培养基平板上的灭菌的*纤维素膜上，3ocI=
倒置培养24小时。将膜于液氮中冷冻，冷冻时间分
别为10 s、30 s、1 rain、2 rain，30cI=放置10 mill，置于浸
没于Z bufer／X．gal(100 ml Z bufer、0．27 ml f≥I巯基乙
醇、1．67 ml 20 mg／m~的X—ga1)溶液的滤纸上(z bufedX．
gal溶液以刚刚浸湿滤纸为佳)，放置于3OcI=下
进行观察，15 rain记录一次，以后可每隔1 h记录一
次。观察不同条件下菌落的颜色变化，划线的酵母
菌落颜色在8 h内显色变蓝的即为阳性结果。同时
没定液氮冷冻时间为1 min，比较处于不同显色温度
(25℃、30℃、37℃)下f；-半乳糖苷酶的活性。
1．7．2 8一半乳糖苷酶的定量分析定量分析AH109
[pGBKT7—053+pGADT7一T]的8一半乳糖苷酶活性，同
时以AH109[pCL1]为阳性对照，AH109[pGBKT7—053
+pG~rr7一T]和AH109[pGBKT~+pGADT~一T]为空载
体对照，AH109为阴性对照。AH109[pCL1]的稀释
倍数为3，其余的稀释倍数为1。具体步骤参照酵母
操作手册。计算p半乳糖苷酶的单位：1000×OD∞／
(t×V×ODao)，其中t为反应时间，V=0．1 ml×稀
释倍数。
参考资料：酵母双杂交技术的影响因素及其实验策略
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时间：2023-09-10 20:16
酵母双杂交：真核生物*转录起始过程的认识
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时间：2023-09-10 20:17
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。
1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能
酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDN*段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。例如：Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交CLONTECH MATCHMARKER SYSTEM 3为操作平台，从*脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并证明了Synphilin-1与alpha-synuclein 之间的相互作用与帕金森病的发病有密切相关。为了研究两个蛋白之间的相互作用的结合位点，找到影响或抑制两个蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1-65个氨基酸残基和Synphilin-1的349-555个氨基酸残基之间是相互作用的位点。研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。
2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用
利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。例如：来源于矮牵牛的黄烷酮醇还原酶DFR与其抗体scFv的反应中，抗体的单链的三个可变区A4、G4、H3与抗原之间作用有强弱的差异。Geert等利用酵母双杂交技术，将DFR作为诱饵蛋白，编码抗体的三个可变区的基因分别被克隆在AD-LIBRARY载体上，将BD-BAIT载体和每种AD-LIBRARY载体分别转化改造后的酵母菌株中，并检测报告基因在克隆的菌落中的表达活性，从而在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。
3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响
酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。
4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（Genome Protein Linkage Map）
众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。
参考资料：http://www.bio-instry.com.cn/forum/dispbbs.asp?boardid=19&id=66
