一招教会你慢病毒包装(带详细教程、滴度测定)
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发布时间：2024-09-26 22:18
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热心网友
时间：2024-10-06 03:24
为了高效生产无菌、无污染的慢病毒，首先确保使用复苏且未超过10代的HEK 293T细胞，这些细胞需在严格的无菌条件下进行操作。转染过程中，可以选择PEI、Higene、lipo2000或lipo3000等试剂，这里以PEI为例说明：
在转染前，准备DMEM无血清无双抗培养基和完全培养基（含10% FBS和1% P/S）。工具方面，包括10毫升的无菌注射器（已灭菌）和0.45μm的细菌滤器。
慢病毒的包装过程分为几个步骤：
第一天晚上7点，将400万细胞铺在10cm的培养皿中，如果计数有困难，可以在细胞密度约90%时进行1:5传代，确保每份有相近数量的细胞。
第二天下午3点，进行三质粒转染。细胞恢复20小时后，按照4:3:1的比例（如PxpAx2:PMD2g:PLVX，其中PLVX含目标基因）进行转染，每10cm dish转染的总质粒量为20微克，PEI用量为质粒的2.5-3倍，建议使用2.5倍比例。具体操作是将质粒与PEI分别溶解在无血清无双抗培养基中，混合均匀后添加到细胞中。
第三天上午9点，转染18小时后更换完全培养基，新手建议留3毫升液体防止细胞移位，更换8毫升培养液。
第四天下午3点，病毒液的收集通常在转染后48-72小时，收集后离心去除细胞碎片，过滤，收集的上清可用于感染和储存。
滴度测定是通过计算感染细胞数和阳性细胞百分比来确定病毒的活性，具体步骤包括用梯度病毒液感染HEK 293T细胞，48小时后检测阳性细胞比例。
最后，注意事项包括保持293T细胞在15代以内（不超过20代）的代数，质粒浓度在400-1000ng/μL，纯度260/280在1.8-2.0，转染时动作轻柔，避免细胞脱落。
热心网友
时间：2024-10-06 03:21
为了高效生产无菌、无污染的慢病毒，首先确保使用复苏且未超过10代的HEK 293T细胞，这些细胞需在严格的无菌条件下进行操作。转染过程中，可以选择PEI、Higene、lipo2000或lipo3000等试剂，这里以PEI为例说明：
在转染前，准备DMEM无血清无双抗培养基和完全培养基（含10% FBS和1% P/S）。工具方面，包括10毫升的无菌注射器（已灭菌）和0.45μm的细菌滤器。
慢病毒的包装过程分为几个步骤：
第一天晚上7点，将400万细胞铺在10cm的培养皿中，如果计数有困难，可以在细胞密度约90%时进行1:5传代，确保每份有相近数量的细胞。
第二天下午3点，进行三质粒转染。细胞恢复20小时后，按照4:3:1的比例（如PxpAx2:PMD2g:PLVX，其中PLVX含目标基因）进行转染，每10cm dish转染的总质粒量为20微克，PEI用量为质粒的2.5-3倍，建议使用2.5倍比例。具体操作是将质粒与PEI分别溶解在无血清无双抗培养基中，混合均匀后添加到细胞中。
第三天上午9点，转染18小时后更换完全培养基，新手建议留3毫升液体防止细胞移位，更换8毫升培养液。
第四天下午3点，病毒液的收集通常在转染后48-72小时，收集后离心去除细胞碎片，过滤，收集的上清可用于感染和储存。
滴度测定是通过计算感染细胞数和阳性细胞百分比来确定病毒的活性，具体步骤包括用梯度病毒液感染HEK 293T细胞，48小时后检测阳性细胞比例。
最后，注意事项包括保持293T细胞在15代以内（不超过20代）的代数，质粒浓度在400-1000ng/μL，纯度260/280在1.8-2.0，转染时动作轻柔，避免细胞脱落。
