首次发现新冠mRNA疫苗体内聚腺苷酸化,增长PolyA尾巴
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发布时间：2024-10-23 16:53
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时间：2024-11-15 19:36
目前，mRNA 疫苗分为四种技术平台：线性修饰 mRNA 疫苗、线性未修饰 mRNA 疫苗、circRNA 疫苗和自复制 saRNA 疫苗。这四种疫苗进入体内后，触发机体免疫系统的过程相似：包裹在 LNPs 中的 mRNA 通过胞吞作用进入细胞，随后逃逸到细胞质，利用宿主细胞的翻译机器合成抗原。肌肉注射的 mRNA-LNPs 疫苗能够感染和激活注射位点附近的免疫细胞，如负责抗原递呈的树突细胞（DCs）和巨噬细胞。这些激活的细胞、mRNA-LNPs 与肌肉细胞产生的抗原迁移到附近的淋巴结，激活机体免疫反应。
尽管研发人员能够描绘出 mRNA 疫苗体内功能的大致路径，但整个 mRNA 疫苗领域仍处于探索阶段。体内 mRNA 的代谢过程，尤其是不同组织和细胞类型如何摄取 mRNA、mRNA 在体内细胞内的稳定性和代谢过程、翻译出的抗原如何诱导免疫反应等，我们了解有限。深入了解这些过程中的关键因子对提升 mRNA 疫苗的免疫效果至关重要。
特别是，关于 mRNA 疫苗体内 PolyA 尾巴的变化，目前几乎没有研究。获批上市的两款 mRNA 疫苗 mRNA-1273 和 BNT162b2 的 PolyA 尾巴组成和长度不同。BNT16b2 的 PolyA 尾巴包含 30 个 A、10 个其他核苷酸（GCAmψAmψGACmψ）和 70 个 A，而 mRNA-1273 的 PolyA 尾巴序列尚未公开。本文将探讨 mRNA-1273 进入体内后，PolyA 尾巴会发生怎样的变化。
首先，需要开发精确鉴定和识别 PolyA 尾巴的测序方法。纳米孔直接 RNA 测序技术（Direct RNA sequenceing, DRS）能够对 mRNA 进行直接测序，获取单个 mRNA 分子的碱基组成。在进行 RNA 测序时，马达蛋白控制 RNA 穿过纳米孔，不同碱基对离子流动造成的阻碍不同，通过分析电流波动信号识别并转换为碱基序列。
使用纳米孔测序方法分析 mRNA-1273 序列时，最大挑战在于序列读取。测序过程中，末端 mψ（假尿苷）会影响读取过程，导致序列准确度仅为参考序列的 74.1%。此外，需要特殊算法鉴定和测量 PolyA 尾巴长度。研究发现，mRNA-1273 的 PolyA 尾巴长度大致在 100 个 A 左右，并且在 PolyA 尾巴和接头序列之间存在一个意外的电流扰动信号，表明 mRNA-1273 末端存在一个独特的非腺苷酸序列。
在细胞水平上，mRNA-1273 的尾巴会发生快速变化。将 mRNA-1273-LNP 转染 HEK193T 细胞和 A549 细胞，经过 72 小时培养后，提取 Total RNA，采用 eDRS 纳米孔测序检测 mRNA-1273 的稳定性以及 PolyA 尾巴长度变化。结果显示，mRNA-1273 的尾巴快速移除末端 mψCmψAG，随后发生去腺苷酸反应，导致 PolyA 尾巴长度不断缩短。
体内 mRNA 的代谢受到多种因素影响。为了研究去腺苷酸反应与 RNA 降解的关系，研究人员在 HEK293T 细胞中敲除了 CNOT1 基因（主要去腺苷酸酶复合物 CCR4-NOT 的支架亚基），发现内源性转录本的 PolyA 长度增加，mRNA-1273 PolyA 尾巴长度缩短。然而，这一现象仅发生在缺乏末端 mψCmψAG 的 mRNA-1273，而完整末端的 mRNA-1273 PolyA 尾巴长度保持不变。
在体内环境中，mRNA-1273 的尾巴会经历不同变化。将 mRNA-1273 注射到小鼠体内后，提取注射位点组织中的 RNA，发现 mRNA-1273 会快速降解，在 24 小时后几乎检测不到。纳米孔测序显示，尽管存在一定程度的去腺苷酸化反应，但注射位点的绝大多数 mRNA-1273 末端含有 mψCmψAG 序列。有趣的是，存在数量的末端缺乏 mψCmψAG 的 mRNA-1273 PolyA 尾巴会延长至 150-200 A。
在巨噬细胞和 DCs 中，mRNA-1273 是否会发生聚腺苷酸化？采用纳米孔测序分析提取自骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）和树突细胞（DCs）的 RNA，结果显示，在两种类型的细胞中，mRNA-1273 都很稳定，转染 72 小时后还能够检测到，转染 4 小时时，25% 的 mRNA-1273 还具备完整的 3' 末端。在巨噬细胞中，转染 24 小时后，mRNA-1273 PolyA 尾巴序列平均延长 20 A，能够增加至 200 A，到转染 72 小时后，PolyA 尾巴序列又回到初始的 100 A 左右。
研究人员进一步探讨了 mRNA-1273 发生重新聚腺苷酸化是由细胞内的哪个酶介导的。基因表达水平分析显示，在 mRNA-1273 注射位点和巨噬细胞中，与免疫反应和细胞激活相关的基因转录水平上调，而与基础代谢相关的基因转录水平下调。在巨噬细胞中，Tent5a 基因表达被诱导，而 Tent5c 基因表达水平很低。在 DCs 细胞中，Tent5a/5c 几乎没有表达。
通过纳米孔测序发现，在敲除 TENT5a 和 TENT5c 基因的巨噬细胞中，mRNA-1273 会更快速地降解和去聚腺苷酸化。这充分说明 TENT5A/C 在 mRNA-1273 PolyA 尾巴代谢方面起着关键作用。
研究还显示，TENT5A/C 的底物是内质网上的翻译产物，且在野生型巨噬细胞中，大部分增加的 PolyA 尾巴编码的内源性蛋白是在内质网上翻译的。共转染 mRNA-1273 和 Fluc-mRNA 到巨噬细胞，发现只有 mRNA-1273 的 PolyA 尾巴增加，而 Fluc-mRNA 的 PolyA 尾巴不会增加，这表明巨噬细胞中 TENT5 介导的提升 mRNA-1273 稳定性的过程在疫苗触发机体免疫反应中发挥着重要作用。
研究结论指出，首次对于 mRNA 疫苗进入体内后 PolyA 尾巴长度变化的研究发现，在巨噬细胞中，TENT5A 聚合酶将 mRNA-1273 重新聚腺苷酸化，增长 PolyA 尾巴，提升其稳定性，增强抗原表达和呈递，从而影响体液免疫反应的强度。为了增强 mRNA 疫苗的免疫或治疗效果，应建立纳米孔直接 RNA 测序平台（eDRS），分析组织和细胞中的 mRNA，并在 mRNA 疫苗生产过程中精确监控 PolyA 长度和 mRNA 序列。
