组织形态学(HE)免疫组化免疫(IHC)荧光(IF)四部曲-之组织包埋
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1 背景知识介绍
1.1 组织多聚甲醛固定原理
多聚甲醛（Paraformaldehyde, PFA）作为化学固定剂，其通过在分子之间形成共价键交联，以保存组织。多聚甲醛固定基于两个主要原理：甲醛易于溶于脂类物质（细胞膜由磷脂双分子层构成），以及多聚甲醛能够与细胞内的氨基基团发生化学交联，形成网状结构，将细胞内的蛋白质固定。实验室常用浓度为4%，此浓度的多聚甲醛在水中溶解时会发生聚合反应，生成长链多聚甲醛。值得注意的是，这种聚合反应是一个生产与分解同时进行的过程，长时间存放会形成白色沉淀。
1.2 酒精脱水原理
酒精（Alcohol）脱水通过促进组织中水分子的蒸发或挥发来实现。酒精具有极高的溶解性和挥发性，以及较强的亲水性。脱水过程涉及以下关键步骤：首先，酒精与水分子接触并质子化，形成质子化水分子，这允许酒精分子与水分子发生物理吸附，形成亲水氢键。接着，水分子因酒精的高溶解度而迅速扩散至脱水液中，导致组织脱水。最后，水分子的蒸发加速，进一步促进脱水。
1.3 二甲苯透明原理
组织透明通过利用二甲苯既能与脱水剂相容又能与石蜡相容的性质实现。在组织脱水后，二甲苯用于替换脱水剂，使石蜡能顺利进入材料中，因为石蜡不溶于水。二甲苯在组织学实验室中作为透明剂使用，有助于提高载玻片的可读性。此外，酒精脱水后，二甲苯能与酒精混合，取代酒精，使石蜡能够渗透组织，从而为后续的包埋过程做好准备。
2 组织包埋完整过程实操（以小鼠睾丸为例）
2.1 准备工作
2.1.1 石蜡预处理（去除杂质和水分）
使用透明、无杂质的石蜡，确保其纯净性。新的石蜡应在70℃下熔化凝固，去除底部的杂质，使用吸水纸擦干。包埋用过的石蜡应回收利用，但需避免组织污染。石蜡应在70℃下熬制，以便去除水分，确保其纯净。在熬制石蜡时需提前开始，至少提前3-4天，以获得高质量的石蜡。
2.2 取样（1cm3左右）
取小鼠睾丸组织样本，通常采用穿刺数次扎孔（10-20次）的方法，确保PFA能充分浸入组织，同时避免破坏白膜。使用新的针头轻刺白膜，孔数根据睾丸大小进行调整。
2.3 固定（目的是为了固定蛋白，使蛋白变性）
使用4% PFA固定整个睾丸组织，固定时间通常为96小时，完成PFA的固定作用，适用于后续实验。
2.4 脱水（脱去组织内水分）
2.4.1 组织固定后，用PBS漂洗组织块3×30min，以去除组织内的固定液，避免影响后续观察、分析。
2.4.2 通过梯度脱水（30%，50%，70%，80%，90%，100%）进行漂洗，每次30min，直至酒精颜色不再黄化。同时回收80%以上的酒精，用于后续实验。
2.4.3 若无法立即进行后续步骤，将组织样本保存在75%酒精中，长期保存。组织在高浓度乙醇中，特别是无水乙醇内不能长时间存放，以避免组织过度硬化和易碎。
2.5 组织透明
使用80%，90%，100%二甲苯各30min进行透明处理，溶出组织内脂肪和多余酒精。注意二甲苯处理会使组织变脆，避免时间过长导致切片困难。
2.6 浸蜡
通过石蜡去除组织中的二甲苯，支撑组织结构以备切片观察。确保浸蜡过程充分，直接影响切片完整性。
3 组织块包埋
3.1 准备工作
浸蜡结束后，将组织块转移至装有石蜡的模具中，确保组织块与蜡充分融合，并做好样品标记。不充分融合可能导致切片时组织与蜡块分离。
3.2 立样
根据小鼠睾丸结构，进行立样操作，确保最终获得睾丸管腔的横切面。立样时，确保睾丸长轴垂直底面，避免组织长界面横躺，影响切片效果。
3.3 冷却凝固
待睾丸稳定立位后，将模具置于室温下凝固，完成后取出蜡块，做好标记。凝固过程中，注意温度控制，避免出现过深凹陷。
3.4 切片
3.4.1 切片前修蜡
凝固完全后，取出蜡块，去除周围多余石蜡，保留组织完整性。我喜欢将其切成宝塔状。
3.5 切片
3.5.1 切片准备
准备载玻片、切片刀、毛笔、小镊子、玻片架、标记用铅笔、水和卫生纸，展片水浴锅调整至42℃。切片前，载玻片需在酸缸中清洗，并使用多聚赖氨酸孵育，以增加组织与玻片的贴合性。切片后，注意标记制作人、样品制作时间、组织名称和切片厚度（通常为5-7μm）。
3.5.2 切片
切片时需小心使用刀具，确保刀具旋钮固定。切片厚度应根据实验需求调整，一般为10μm以下。利用水的表面张力在水中展片，切片后，使用毛笔轻轻拉展蜡片，避免损坏台座。清除杂质时，应向上扫动，避免留下划痕。为避免蜡片回卷，可事先用75%酒精擦拭刀台面。切片时，应注意匀速转动摇柄，避免过快。每连续切片4个左右细胞或视野，可使用不同抗体染色。
结束
实验过程较为复杂，建议在实验前与实验室前辈进行学习。完成实验后，注意机器的清理与维护。每文格言作家苏芩曾说：“人不需要有那么多过人之处，能扛事就是才华横溢。”关注博主GBhouse，点赞+讨论是持续更新的动力。
